[发明专利]LDL受体基因敲除的基因工程仓鼠

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程动物领域，更具体地说，涉及通过CRISPR/CAS9基因编辑技术构建的LDL受体基因敲除的仓鼠。

背景技术

高胆固醇血症(hypercholesterolemia)是动脉粥样硬化和心血管疾病最重要的独立危险因子之一，并与诸多遗传和环境因素有相互作用。家族型高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia)是原发性高胆固醇血症之一，其发病机理主要是低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体的基因突变功能下降或丧失，血浆LDL清除减慢，胆固醇水平升高，导致早发性心脑血管疾病并常伴有皮肤和肌腱黄色瘤(1,2)。

选择恰当的疾病动物模型是研究人类疾病发生、发展及转归，药物筛选及药理学研究的必然手段。小鼠因其体积小、繁殖快、费用低，更因为有多种基因工程模型，因此广泛用于各种疾病的实验研究。小鼠对动脉粥样硬化不易感，以往基本不用于动脉粥样硬化的研究；直至载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)(3)和低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因敲除小鼠(4)的问世，小鼠迅速变成了代谢性心血管病研究领域中最常用的模式动物。apoE和LDL-R纯合子KO小鼠可以自发动脉粥样硬化病变(5)，高脂饲料可加速这种病变的发生。然而由于小鼠脂代谢与人类差异较大，对药物的敏感性不同，一些基于小鼠取得的研究结果在临床应用上存在一定争议(6)。此外，小鼠动脉粥样病变多发于主动脉和流出道，极少累及冠脉和脑动脉。因此，基于apoE KO和LDL-R KO小鼠高胆固醇血症的心脑血管并发症的研究，缺乏冠状动脉和脑动脉病变的基础病因和病生理基础，不能模拟人类冠心病和中风的自然发病过程，有明显局限性。

发明内容

本发明一方面提供了一种基因工程仓鼠，其中该仓鼠体内的LDL受体基因被敲除。

在一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除纯合子。在另一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除杂合子。

在一些实施方案中，该仓鼠的血脂水平显著升高。

本发明另一方面提供了一种制备基因工程仓鼠的方法，包括：将该仓鼠体内的LDL受体基因敲除。

在优选实施方案中，所述LDL受体基因通过CRISPR/CAS9基因编辑技术被敲除。在一些具体实施方案中，其中所采用的sgRNA序列为仓鼠LDL受体基因的互补序列，其靶向LDL受体基因为第二外显子。例如，在一个实施方案中，所采用的 CRISPR-Forward和sgRNA-Reverse序列分别如SEQ ID NO:2和3所示。

在一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除纯合子。在另一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除杂合子。

本发明另一方面提供了一种筛选用于治疗人类心血管疾病的药物的方法，包括以下步骤：

a)将候选药物给予LDL受体基因被敲除的基因工程仓鼠，

b)测定给药之前和给药之后所述基因工程仓鼠体内的血脂水平，以及

c)如果所述基因工程仓鼠体内的血脂水平在给药之后显著降低，则所述候选药物被评定为有效。

在一些实施方案中，所述心血管疾病可以选自由高脂血症、高胆固醇血症和动脉硬化症构成的组。

在一些实施方案中，所述血脂水平可以为血液胆固醇水平和/或甘油三酯水平。

在一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除纯合子。在另一些实施方案中，该仓鼠为LDL受体基因敲除杂合子。

本发明另一方面提供了所述基因工程仓鼠在筛选药物中的应用，其中所述药物用于治疗人类心血管疾病。

在一些实施方案中，所述心血管疾病选自由高脂血症、高胆固醇血症和动脉硬化症构成的组。

附图说明

图1显示了LDL-R基因敲除仓鼠的构建。(A)引导RNA在LDL-R基因第二外显子上识别位点示意图，其中蓝色字体为识别序列，红色字体为PAM序列。(B)两只构建成功乳鼠的LDL-R基因序列片段，其中蓝色字体为识别序列，红色字体为PAM序列，绿色字体为点突变序列，虚线部分为缺失序列，突变类型标注于每行末端。(C)LDL-R缺失Δ194bp仓鼠组织经PCR扩增后的DNA凝胶电泳图，缺失片段DNA长度为394bp。