[发明专利]穿膜肽TAT2在转基因棉花培育中的应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及穿膜肽TAT2在转基因棉花培育中的应 用。

背景技术

棉花是当今世界最重要的天然纺织纤维原料，也是我国重要的经济作物和战略储 备。中国不仅是纺织品出口和生产大国，也是纺织品消费大国。然而，中国棉花生产由于受 耕地面积减少、粮食安全和粮棉比价等因素影响，种植面积不可能大幅度增长，棉花增产增 效的唯一途径是加强科技创新，提高棉花生产的科技水平和单产水平。除耕地因素外，干 旱、盐碱、病害、虫害等生物及非生物因素也显著影响棉花的产量和品质。

传统棉花品种选育受种质资源限制，而且周期长。转基因手段能够有效克服上述 限制，通过转基因技术将调控产量、品质及抗逆性的基因引入棉花中，可培育出产量、品质 和抗逆性优良的棉花新品种。棉花转基因应用不受食品安全限制，上世纪我国应用转基因 抗虫棉为防治棉铃虫做出了重大贡献。

棉花转基因手段主要分三种，即农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法。农杆菌 介导法需建立棉花组织培养体系、转基因效率严格受到受体基因型限制。基因枪法需要价 格高的基因枪，而且转化率低。花粉管通道法无需组织培养、不受受体基因型限制、无需昂 贵的仪器设备、操作简便、可以大规模进行遗传转化，目前被广泛使用。花粉管通道技术的 主要限制因素是转化效率偏低。

穿膜肽（cellpenetratingpeptides，CPPs）是一种具有细胞穿透功能的小分子 多肽。在医学领域中，穿膜肽可帮助具有治疗功效的蛋白多肽等大分子物质进入细胞从而 提高治疗效果。近年来研究发现，CPPs可以有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大 分子进入细胞，且不会造成细胞损伤。根据其氨基酸组成，可分为阳离子CPPs和两性CPPs。.

在植物转基因领域中，穿膜肽已经在多种植物中证明对基因有携带作用。Unamalai等 利用CPPs将小分子siRNA导入烟草悬浮细胞（Unnamalaietal.,Cationic oligopeptide-mediateddeliveryofdsRNAforpost-transcriptionalgene silencinginplantcells,FEBSLetters,2004,566(1):307-310）。M?e等将荧光素 成功导入烟草原生质体（M?eetal.,Internalisationofcell-penetratingpeptides intotobaccoprotoplasts,BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes, 2005,1669(2):101-107）。GUS蛋白和编码钙蛋白的7.2kb线性质粒DNA均能通过与CPPs 混合导入小黑麦（Chughetal.,Translocationofcell-penetratingpeptidesand deliveryoftheircargoesintriticalemicrospores,PlantCellReports,2009, 28(5):801-810）。FDA标记的CPPs被成功导入烟草悬浮细胞（Chughetal.,Cellular uptakeofcell-penetratingpeptidespVECandtransportaninplants,Journal ofPeptideScience,2008,14(4):477-481）。也有研究利用CPPs将抗旱基因通过花粉 管通道法转入玉米（韩猛,线性DNA结合细胞穿膜肽的花粉管通道法将AtCKX3导入玉米自 交系的研究,学位论文,长江大学,2015）。但尚未见将CPPs用于转基因棉花培育的相关 报道。

发明内容

本发明主要目的是提供穿膜肽TAT2在培育棉花转基因新品种中的新应用途径，同 时提供一种由穿膜肽TAT2介导的棉花花粉管通道转基因新方法。

本发明所采取的技术方案如下：

穿膜肽TAT2在转基因棉花培育中的应用，用于携带拟转化DNA片段进入棉花基因组；所 述穿膜肽TAT2，包括18个氨基酸，序列如SEQIDNO.1所示，具体为：

Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg；

即RKKRRQRRRRKKRRQRRR；