[发明专利]一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L-叔亮氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L‑叔亮氨酸的方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。本发明方法包括向反应体系中添加底物三甲基丙酮酸，葡萄糖，调节体系的pH值在8.0‑9.0，加入经过外加烟酸等物质的培养基培养过的共表达菌株破碎的粗酶液(包含亮氨酸脱氢酶，葡萄糖脱氢酶及辅酶)之后开始反应，通过控制反应过程的温度在25‑30℃，pH值在8.0‑9.0，生产L‑叔亮氨酸。本发明通过采用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶体系，利用菌体自身含有的辅酶，进行L‑叔亮氨酸制备，具有单批次反应底物浓度高，反应效率高，不需要辅酶添加等特点。

技术领域

本发明涉及一种利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶制备L-叔亮氨酸的方法，属于酶工程和手性医药中间体制备技术领域。

背景技术

光学纯L-叔亮氨酸，所含的叔丁基团不仅具有空间位阻效应还具有较强的疏水性，从而被广泛用作不对称催化合成的模板。同时其作为一种非自然界的氨基酸，也常常应用于药物活性肽当中。有研究报道了L-叔亮氨酸用于抗肿瘤药物试剂，抗艾滋病蛋白酶抑制剂等药物。正是由于L-叔亮氨酸的广泛应用，大量的合成方法被开发报道。其中主要包括化学拆分法、化学不对称合成法、酶拆分法，以及酶还原氨基化合成法(Bommarius et al.,1995)。由于近年人们环保意识的增强，具有反应条件苛刻，反应流程复杂，反应效率低的化学合成方法逐渐被生物合成法代替。在酶拆分合成的方法中，主要用到的一些酶包括青霉素酰化酶，脂肪酶，蛋白酶等(Abderhalden,Faust,&Haase,1934；Agosta et al.,2006；Turner,Winterman,McCague,Parratt,&Taylor,1995)。由于酶拆分方法存在着操作步骤繁琐以及理论产率只有50％的原因，一直没有相关方法工业应用的报道。

酶还原氨基合成方法，具有操作简单以及理论产率100％的特点。目前主要用到的酶包括两种，分别是侧链氨基转移酶和亮氨酸脱氢酶。Hong等报道了利用侧链氨基转移酶合成L-叔亮氨酸，转化率大于90％，但是催化的底物浓度过低达不到工业要求(Hong,Cha,Yun,&Kim,2010)。另外一种利用亮氨酸脱氢酶合成L-叔亮氨酸在90年代由Degussa(德国)公司开发，并应用于工业生产。该方法运用酶膜反应器，将亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶固定在酶膜上，其中甲酸脱氢酶能够催化NAD⁺生成NADH，实现辅酶的再生，减少辅酶的用量(Liese,Seelbach,&Wandrey,2006)。亮氨酸脱氢酶催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸被认为是最有工业前景的合成路径。

近些年来关于亮氨酸脱氢酶合成路径的专利报道包括中国专利201110202325.4，201210508084.0，201410695848.0，201310044292.4等。这些合成路径都存在以下问题：1.反应需要外加辅酶，而辅酶价格昂贵，经济性差，如果能够在合成工程中不加入辅酶的话，将会大幅度减少工业生产过程的成本；2.甲酸脱氢酶活性低，在不对称转化过程中需要添加大量的甲酸脱氢酶，才能够充分发挥亮氨酸脱氢酶催化合成效果，增加了酶投入的成本；3.反应效率较低，正是由于反应过程中用到的活性较低的甲酸脱氢酶，影响辅酶转化效率，增加完全转化底物所需要的反应时间，使得反应效率较低。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用共表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶菌株的破碎粗酶液作为催化剂，进行催化三甲基丙酮酸生产L-叔亮氨酸。本发明用到的葡萄糖脱氢酶相对甲酸脱氢酶具有更高的酶活，从而提高辅酶利用效率。采用粗酶液的反应形式能够忽略底物对于菌体细胞的抑制，提高底物浓度。通过在菌体培养过程中外加烟酸，提高胞内辅酶浓度，而实现反应中零辅酶添加。最终，实现了利用亮氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶来高效制备L-叔亮氨酸。

本发明的目的是提供一种制备L-叔亮氨酸的方法，是在含有葡萄糖、底物三甲基丙酮酸反应体系中添加共表达亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的重组菌的细胞破碎粗酶液，搅拌反应。