[发明专利]一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、 慢病毒，本发明还涉及一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒的构建方法 及应用。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有 感染能力，慢病毒目前可以在细胞或者体内实现长效的外源基因表达和基因沉 默。

微小RNA(microRNA，miRNA)是目前研究最多的一类内源性非编码小 分子RNA，长度约为19-23nt，miRNA能够在转录后水平上对基因的表达进行 负调控，导致mRNA的翻译抑制或降解，抑制蛋白质的合成，产生基因沉默 效应。作为miRNA中的一员，mmu-miR-199b-5p是2003年由Lagos-Quintana 首先从鼠细胞克隆得到，随着对其研究的不断深入，mmu-miR-199b-5P基因在 子宫内膜癌、卵巢癌、子宫内膜异位症等多种疾病中都有异常的表达。 mmu-miR-199b-5p通过影响细胞增殖、调亡、侵袭和血管形成，参与肿瘤形成 发展的各个阶段。目前，miRNA在妇科常见疾病如子宫内膜癌、卵巢癌以及子 宫内膜异位症中发挥作用的具体调控机制还不是十分清楚，但已有证据表明 miRNA参与调控其发生发展。随着miRNA的深入研究，有望可能作为一种新 的肿瘤生物学标记物，对其在癌前病变以及恶性肿瘤中的特异表达进行检测， 有助于对妇科恶性肿瘤的早期诊断，尤其有助于对那些早期无明显临床症状的 肿瘤患者进行筛选。

然而现有技术的缺点是，缺乏一种干扰mmu-miR-199b-5p基因表达的慢病 毒干扰载体。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体、慢病毒、构建方 法及应用，解决了现有技术中缺乏一种干扰mmu-miR-199b-5p基因表达的慢病 毒干扰载体的问题。

本发明的第一个目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体，将购买的 慢病毒干扰载体PCGUR，经内切酶AgeI和内切酶EcoRI双酶切后，得到一个 长序列片段和一个短序列片段，然后在所述长序列片段内，连入改造的 mmu-miR-199b-5p基因特异片段，得到重组PCGUR慢病毒干扰载体，所述改 造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3 所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

本发明的第二个目的是提供一种重组PCGUR慢病毒干扰载体的构建方 法，具体按照以下步骤实施：

步骤1，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段

步骤1.1，化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其 核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；

化学合成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的反义链，其核苷酸序列 如SEQIDNO.4所示；

步骤1.2，将步骤1.1中获得的正义链配置成正义链溶液，将步骤1.1中获 得的反义链配置成反义链溶液，经退火反应，获得改造的mmu-miR-199b-5p基 因特异片段；

步骤2，获得重组PCGUR慢病毒干扰载体

步骤2.1，购买慢病毒干扰载体PCGUR，并利用内切酶AgeI和内切酶EcoRI 对慢病毒干扰载体PCGUR进行双酶切，得到一个长序列片段和一个短序列片 段，然后将长序列片段进行回收，获得慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段 产物；

步骤2.2，将步骤1.2中获得的改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段和 步骤2.1中获得的慢病毒干扰载体PCGUR的长序列片段产物，经T4DNA连 接酶连接，获得连接产物，然后将所述连接产物回收，获得重组PCGUR慢病 毒干扰载体。

优选的，所述步骤1中，获得改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段，具 体按照一下步骤实施：

步骤1.1a，化学合成mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链，其核苷酸 序列如SEQIDNO.1所示，并在其5’端添加核苷酸序列ccgg，在3’端添加核苷 酸序列ttttttg，形成改造的mmu-miR-199b-5p基因特异片段的正义链；