[发明专利]RNA甲基化测序文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及RNA测序领域，具体而言，涉及一种RNA甲基化测序文库的构建方法。

背景技术

表观遗传学是指在基因组DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达和调控发生 了可遗传的变化，其现象主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记和RNA修饰等。其中 RNA甲基化修饰广泛存在于哺乳动物、植物等真核生物中，主要的存在形式有m⁷G、N_m、m⁵C、 m⁶A和m⁶A_m。不同形式的RNA甲基化在调控生物生长发育等过程中起着至关重要的作用，例如 m⁷G参与mRNA的翻译修饰、转移、剪切等，N_m甲基化经常用作宿主细胞识别自身mRNA和外源 mRNA的分子标记，而通过基因敲除等实验显示m⁵C、m⁶A在调控顶端发育和细胞命运等方面发 挥重要作用。甲基化修饰不改变沃森克里克配对，基于常规的反转录构建文库测序的方法 无法鉴定m⁶A等RNA甲基化修饰位点，因此基于RNA免疫共沉淀(RNAImmunoprecipitation， RIP)的甲基化的RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)方法对研究RNA甲基化位点非常必要。

1970s中期，在哺乳动物(1975年)、病毒(1976年)、果蝇(1978年)和植物(1979年) 中陆续发现了m⁶A的存在，2011年首次发现了RNA甲基化修饰可逆化，近些年的研究发现RNA 的这种可逆修饰广泛存在于多种真核生物细胞中。RNA复杂的结构和功能关系使对RNA甲基 化修饰的研究受到抑制。2012年DanDominissini等建立了m⁶A-seq技术，成功实现了人和 小鼠转录水平上m⁶A高分辨率定位，并于2013年将这种基于免疫沉淀技术的MeRIP-seq方法 发表于NatureProtocols，成为首个从整个转录水平研究RNA修饰的方法。

MeRIP-seq方法的产生主要基于染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)和甲基化的 DNA免疫沉淀测序(MeDIP)方法的发展，通过RNA甲基化识别抗体特异结合发生甲基化的 RNA，对富集得到的RNA片段进行测序，通过测序序列(reads)的密度分布鉴定甲基化位点， 推测甲基化位点保守区域(motif)，并对发生RNA甲基化修饰的相关基因进行注释分析。基 于RIP-seq对RNA甲基化进行定位分析的方法，对研究RNA甲基化修饰在真核生物中的生物 学功能有重要意义。

下面以m⁶A甲基化的建库流程来详细说明现有技术中所存在的缺陷：

基于免疫沉淀法RNA的m⁶A甲基化的高通量测序文库构建的原理是通过甲基化特 异性的抗体与片段化后的mRNA中的m⁶A甲基化结合，再通过蛋白A(蛋白A)磁珠将抗体富集 下来，最终在RNA提取后进行文库构建。具体的建库流程为：

(1)将总RNA通过Dyna磁珠oligo(dT)磁珠进行mRNA富集；

(2)将富集后的mRNA浓缩到1ug/ul，加入片段化缓冲液，进行盐离子打断，用0.5M EDTA进行终止打断过程；

(3)利用乙醇过夜沉淀片段化的RNA，然后收集溶解RNA，并留取一小部分做上样对 照(input)，另一部分用来进行免疫沉淀(IP)实验；

(4)将待IP的样品等分为两管，均分别加入IP缓冲液和RNA酶抑制剂，其中一管加 入抗体，一管不加抗体(作为对照)放于4℃，旋转混匀仪上孵育2h；

(5)在抗体孵育的同时，向200μL蛋白A磁珠离心弃上清，重悬于添加有BSA的IP缓 冲液中，然后置于4℃的旋转混匀仪上孵育2h进行预封闭；

(6)将预封闭后的蛋白A磁珠等分两份，离心弃上清，将孵育好的样品(加抗体和不 加抗体)转移到含磁珠的离心管内，然后置于4℃的旋转混匀仪上孵育2h；

(7)离心弃掉磁珠中的上清，加入洗脱液进行洗脱；

(8)将洗脱液离心，收集上清，进行RNA提取；

(9)对得到的RNA进行反转录以及cDNA二链合成反应；

(10)将合成的双链DNA用XP磁珠纯化后进行末端修复加A反应；