[发明专利]一种石斛超低温保存脱毒的方法

权利要求书

1.一种石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），选择1月苗龄的带有CyMV和ORSV病毒的石斛组培苗，取石斛组培苗带有单芽的茎段1.0-1.5cm，接种到基本培养基上，在4℃黑暗条件下炼苗3-5周；所述1月苗龄是继代培养1月的石斛组培苗，苗高度为2-3cm；

所述基本培养基为：1/2MS+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；

步骤（2），从步骤（1）所炼的苗上剥取1-3mm长的茎尖，然后将茎尖在4℃黑暗条件下预培养1-3d；接着在超净工作台上，采用高糖加载液对茎尖加载20-40min后，将茎尖转移到玻璃化溶液PVS2中脱水30-60min，再将茎尖投入液氮中保存30min-1h，之后将茎尖在室温下迅速转入卸载液中解冻并卸载20-30min，或是将茎尖在37℃水浴中解冻3-4min再转入卸载液中卸载20-30min，卸载后的茎尖接种到成活培养基上，先暗培养1-3d，后转入正常光照下继续培养，获得石斛脱毒苗；

所述预培养的培养基为：1/2MS+0.3-0.6mol/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；

所述加载和脱水过程都在冰上进行；

所述高糖加载液为：1/2MS+2mol/L甘油+0.3-0.7mol/L蔗糖，pH5.8；

所述玻璃化溶液PVS2为：1/2MS+0.4mol/L蔗糖+30%w/v甘油+15%w/vDMSO，pH5.8；

所述卸载液为：1/2MS+1.2mol/L蔗糖，pH5.8；

所述成活培养基为：1/2MS+0.1-0.2ml/L NAA+0.1-2.0ml/L 6-BA+50g/L马铃薯+25g/L香蕉+7g/L琼脂，pH5.8；

所述正常光照培养是在温度25±1℃、光照强度1000-2000lx、光照12h/d的条件下进行培养。

2.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，步骤（2）中在体视显微镜下剥取1-3mm长的茎尖。

3.根据权利要求1所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，将茎尖投入液氮中保存时采用小滴玻璃化法或玻璃化法。

4.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的小滴玻璃化法是将铝箔纸剪成（0.8-1）cm×（2-2.2）cm长条形的铝箔条，将经PVS2脱水处理后的茎尖放到铝箔条光滑的一面上，向茎尖上滴加PVS2，使茎尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后将铝箔条直接浸入液氮中进行冷冻，冷冻后将铝箔条装入冻存管中，拧紧盖子，最后投入液氮中保存。

5.根据权利要求3所述的石斛超低温保存脱毒的方法，其特征在于，所述的玻璃化法是将经PVS2脱水处理后的茎尖放入冷冻管中，向冷冻管加入PVS2使茎尖浸泡在PVS2中，盖紧盖子后直接将冷冻管投入液氮中保存。