[发明专利]一种快速鉴别新城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物及鉴别方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和分子病毒学领域的病毒检测技术，特别涉及一种快速鉴别新 城疫强毒株的逆转录荧光定量PCR引物，还涉及使用所述引物的鉴别方法。

背景技术

新城疫（Newcastledisease,ND）是由新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)引起 的一种急性、高度接触性禽类传染病，是世界动物卫生组织（OIE）规定的法定报告疫病，给 许多国家的养禽业造成巨大的经济损失。NDV又称禽副黏病毒1型，在分类上属于单链负股 病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亚科的禽腮腺炎病毒属。NDV基因组包含6个开放阅读框，从 5’到3’依次编码L-HN-F-M-P-NP6种结构蛋白，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一，病毒毒 力的强弱与其裂解位点区的氨基酸序列相关，强毒株氨基酸序列一般为¹¹²R/K-R-Q-K/R-R- F¹¹⁷，而弱毒株则改变为¹¹²G/E-K/R-Q-G/E-R-L¹¹⁷，氨基酸序列的变化导致了NDVF0蛋白不 易被裂解，从而降低了病毒囊膜与宿主细胞膜的融合活性，使病毒感染性降低或者无感染 性，这也是在基因水平上区分NDV强、弱毒株的把点，因此，可以以此进行NDV强弱毒株的区 分。

目前，我国对于新城疫的防控依赖于疫苗，有效的疫苗和合理的免疫程序很大程 度上控制了该病的爆发和流行。但由于我国养殖环境复杂，标准化、规模化养殖水平不足， 致使新城疫疫情时有发生，并常以非典型病症呈现，所以必须经实验室诊断进行病例的确 诊和病毒的分离、鉴定。NDV检测主要使用PCR技术和血清学技术，而分离鉴定则主要采用鸡 胚接种传代方法。然而，由于疫苗（灭活疫苗和弱毒苗）的广泛使用和一些天然弱毒株的存 在,从免疫鸡群中检测到的NDV可能是被接种的疫苗病毒或者是不至于引起发病的弱毒 株,所以即使检测和分离到了NDV,也不能确定鸡群感染了野毒，发生了新城疫疫情。所 以，准确掌握NDV的感染情况，首先要排除疫苗毒的干扰。建立快速、准确区分NDV强、弱毒株 的方法，可以第一时间确定是否发生了新城疫疫情，以便有效控制危害性大的NDV强毒对鸡 群的感染。

黄淑坚等（养禽与禽病防治，2009，4:18-21）设计了两对特异性引物建立了区分 NDV强、弱毒的PCR方法（检测敏感性为10pg，换算成拷贝数大概为10⁵拷贝）；岳华等（中国 兽医学报，2007,27（3）：300-304）建立了基于TaqMan探针的检测中、强毒力新城疫病毒RNA 的荧光定量方法（TaqMan探针造价高，检测敏感性为60拷贝），但前者在操作的简便性和灵 敏度方面有所欠缺，后者则在检测成本和灵敏度方面有提升空间。公开号为CN101153343A 的中国发明专利申请，公开了一种特异检测强毒型和中毒型鸡新城疫病毒的荧光定量PCR 引物及方法，来鉴别强毒型和中毒型鸡新城疫病毒，但灵敏度方面依然不够理想。

发明内容

为了解决以上鉴别强弱毒鸡新城疫病毒技术中存在的成本高、敏感性差的问题，本发 明提供了一种快速、灵敏、低成本的区分NDV强弱毒株的方法。本发明基于NDV强、弱毒基因 序列的分析，通过特异性引物的设计，建立标准曲线，最终构建了基于SYBRGreenⅠ嵌合荧 光的鉴别NDV强毒的逆转录荧光定量PCR(reversetranscriptionfluorescence quantitativePCR，RT-qPCR)方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

本发明所述的特异性引物的设计，是根据GenBank中登录的所有NDVF基因序列，筛选 与强弱毒裂解位点关联一致的序列，然后根据强毒的序列特征设计一对特异性引物，从而 达到只扩增强毒而不扩增弱毒的目的。引物序列如下：

NDVFrealtime-1:5’-AGGACGGAGACARAARCGCT-3’

NDVFrealtime-2:5’-AGTCGGAGGATGTTGGCAGC-3’

扩增产物长度为131bp。另设计合成了含T7启动子的上游序列NDVFrealtime-T7-1: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGGAGACARAARCGCT-3’，用于体外转录模板的制备。