[发明专利]肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法

说明书

本发明提供一种肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法，属于生化检验技术领域，该方法包括：（一）标本染色步骤：（二）标本染色后化学法检测步骤：a.石蜡切片脱腊及水化；b.抗原修复；c.清除内源性过氧化物酶活性；d.封闭；e.一抗孵育；f.二抗孵育；g.加入辣根酶标记链霉卵白素液，孵育30分钟；PBS洗涤洗5min×3次；h.DAB显色；i.细胞核复染；j.封片。该肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法有利于探讨STC患者肠黏膜BDNF的表达改变及与排便障碍的相关性，并观察STC患者肠黏膜神经纤维密度和超微结构的异常。

技术领域

本发明涉及生化检验技术领域，具体地说是一种肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法。

背景技术

一般的，结肠慢传输型便秘(slowtransitconstipation,STC)是以结肠传输无力导致大便驻留时间延长为特点的顽固性便秘。有研究证实STC的发病与肠神经系统病变有关。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养物质的一员，在神经系统的形态可塑性方面发挥重要的调节作用。近来研究发现，BDNF在肠神经系统、肠黏膜上皮和肠肌层均有表达。Lommatzseh，等通过原位杂交实验发现小鼠整个肠道内环肌和肠上皮组织BDNFmRNA有阳性表达。Boesmans等取膝鼠的回肠组织，在其肌间神经丛及粘膜下神经丛检测到有大量BDNF与其受体TrkB的表达，肠上皮组织亦有明显的BDNF表达。BDNF能促进神经元间连通结构的形成，在突触的成熟及可塑性过程中发挥重要作用，并在肠神经元可塑性调节及胃肠道感觉、动力调节中发挥重要作用。然而，BDNF是否参与STC患者排便障碍的发生，且引起STC患者肠黏膜神经纤维可塑性改变的研究少见报道。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，该肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本的染色化学检测方法包括：

（一）标本HE染色步骤：

（1）脱蜡与水化：肠黏膜脑源性神经营养因子BDNF标本干燥后的切片用二甲苯脱蜡，再逐级经纯酒精及梯度酒精直至蒸馏水；

（2）苏木精液染色60s；

（3）流水洗去苏木精液10s；

（4）1%盐酸乙醇洗3s ；

（5）水洗2s；

（6）促蓝液返蓝洗10s；

（7）流水冲洗30s；

（8）伊红染色60s；

（9）蒸馏水洗2s；

（10）80%乙醇洗2s；

（11）95%乙醇洗2s；

（12）无水乙醇洗2s；

（13）石炭酸二甲苯洗3s；

（14）二甲苯洗3s；

（15）二甲苯洗3s；

（16）中性树胶封固，封片时每片载玻片滴加1～2滴明胶，将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡；

（二）标本染色后化学法检测步骤：

a.石蜡切片脱腊及水化

a1.脱蜡：将染色后切片放入染色筐中，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各放置15min进行完全脱腊；