[发明专利]一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法

说明书

本发明公开了一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法：利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测GPC3表达情况。通过该技术方法，不用取材肝癌组织即可检测到肝癌患者外周血中GPC3表达情况，为肝细胞癌诊断提供依据。该技术属于微创甚至无创，并能够实时检测。

技术领域

本发明涉及一种检测外周血GPC3的方法，尤其对未获得病理诊断的肝细胞癌患者，通过检测外周血中GPC3，进一步明确肝细胞癌诊断。

背景技术

GPC3(Glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3)是一种膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白(heparan sulfate proteoglycan,HSPG)，相对分子质量约66kDa，其基本结构包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)链和糖基磷脂酰肌醇(GPI)，通过GPI锚定于细胞表面，可以结合多种生长因子并调节其活性，进而在生长发育和癌变过程中起关键作用。GPC3主要通过Wnts信号途径产生作用，GPC3在正常组织中表达及分布有明显的组织特异性和组织分化的时相特异性。研究表明在人体的胚胎期，胎盘和胎儿组织中富含GPC3mRNA，胃肠道和肝、肾和肺中都有GPC3的高度表达，其中以肝脏表达水平最高。而在成人，GPC3高表达在胎盘组织，在卵巢、肾脏、肺脏、心脏等少数组织呈低水平表达，不表达于正常的肝脏组织。研究证实GPC3蛋白在肝癌组织中高表达，而在非癌组织中没有表达或表达量极低，说明GPC3和肝癌有特定的关系，GPC3具有抑制肿瘤的生长，更加说明GPC3在肝癌表达的特异性和在肝癌作用机制的特异性；同时还有研究表明GPC3在肺癌、乳腺癌、间皮瘤、肾癌和卵巢癌组织中表达缺失。有研究表明研究显示:GPC3在80％-90％肝癌组织中表达显著上调，在正常成人组织及肝炎、肝硬化患者组织和其它肿瘤中低水平表达或不表达，在AFP阴性的HCC中也有较高表达。对肝癌、肝细胞癌、肝硬化再生性瘤、结节增生的肝组织进行免疫组化检测，发现肝癌组织中GPC3阳性率达75.7％，而在良性肿瘤中GPC3阴性。GPC3在90％的HCC中呈阳性，且特异性高达100％，但在转移性肝癌和良性肝病中阴性。因此，GPC3不仅可以用于鉴别肿瘤的良、恶性，还可以鉴别HCC与转移性肝癌。

目前肝细胞癌的诊断包括病理学诊断和临床诊断，病理学诊断是肝癌诊断的金标准，临床诊断标准主要包括慢性肝病背景、影像学检查结果和血清肿瘤标记物水平三方面内容。但对于无法获得病理诊断或临床诊断依据不充分的部分肝癌患者，检测GPC3的表达状况变得十分困难。

发明内容

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)是从实体肿瘤脱落而进入外周血液循环的肿瘤细胞，聚集成团形成循环肿瘤微栓(Circulating tumor thrombus，CTM)，它们存在于多种恶性肿瘤中，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时等特点，被称为“液态活检”。

为了克服临床诊断依据不足的肝癌患者不适宜组织标本取材或避免穿刺活检造成肿瘤播散等问题，无法明确肝癌诊断的不足，本发明提供了一种肝细胞癌患者外周血GPC3检测方法：利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而检测GPC3表达情况。

本发明所采用的技术方案如下：

一、利用膜过滤装置分离获取无法获得组织标本的肝癌患者外周血中的CTC：

1、采集晚期肝癌患者外周血：肘正中静脉5ml；

2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为0.25％；

3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中，使其依靠重力自然过滤；