[发明专利]一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒

说明书

本发明公开一种用于检测HBV‑B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法；所述试剂盒包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV‑B病毒基因阳性质控、HBV‑C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；方法包括如下步骤：1）受检样品处理；2）质控品的处理；3）配制数字PCR反应混合液；4）生成微反应液滴，并进行数字PCR反应扩增；5）读取荧光信号，分析HBV型别并计算各自拷贝数。本发明采用数字PCR技术和双色荧光探针，同时检测HBV的两个亚型，且不依赖于外来标准物及标准曲线，操作简便，可直接对HBV精准绝对定量。

技术领域

本发明属于分子诊断生物学技术领域，具体涉及一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒是导致人类急性和慢性乙型肝炎的病原体，它能引起肝脏细胞的严重损伤，并且持久稳固的HBV感染与肝硬化及肝癌的发生密切相关，对人类的健康危害极大。据估计，全世界感染过HBV的人数大约有20亿，并且超过3.5亿的感染者具有持久稳固和慢性感染；每年因HBV感染导致的相关疾病死亡人数可达60万-100万。HBV在世界各地的流行感染率差别极大，在亚洲东部地区HBV的感染流行率最高，而在北美和欧洲的西北部地区流行率很低。中国HBV感染人数超过7亿，其中约1.2亿携带者，3000万慢性感染者，每年新增HBV感染人数约50万，是世界上HBV感染率最高的国家之一。

不同HBV基因型可以导致不同的临床表现及预后。有研究表明基因B型感染者较C型感染者较少发生肝损害，且基因B型感染者较C型不易发展至肝硬化、炎症程度较轻；基因C型感染者其肝脏炎症坏死评分高于基因B型感染者，基因C型感染者容易发展为肝硬化和肝癌。在中国主要流行HBV-B/C型。因此，HBV基因分型检测可以在乙肝炎患者的临床类型、预后判断及治疗方法的选择等方面发挥重要的作用。

乙型肝炎病毒表面抗原的血清学检测在HBV感染的诊断中起着重要作用。目前采用免疫学方法检测HBV血清学标志物广泛用于急、慢型感染的诊断、疗效观察和预后判断。然而，由于HBV亚型和变异株的存在以及病毒的免疫逃逸，即使在HBV携带者血液中，检测不到HBsAg且抗HBsAg抗体阳性，仍然不能确定该携带者体内的HBV已经完全清除，也不能排除其他将来发生与HBV感染相关的严重肝脏疾病并发症的可能。HBV的血清学诊断是间接诊断，不能直接反映病原体的存在，故用这些血清学标志物检测疾病的发展有一定的限制。分子诊断技术的引入为直接和真实地反映患者体内病毒复制水平，以及判断患者病情、疗效和预后提供了可能。

目前HBV基因分型的分子诊断主要包括核酸杂交法、基因芯片和荧光PCR法等。其中核酸杂交包括斑点杂交、液相杂交、支链DNA技术等方法，但是由于杂交步骤较为繁琐，在大样本研究中耗时较长，易导致交叉杂交反应，而存在着一定的不足；基因芯片由于其成本较高，制作工艺复杂，而且信号检测需要专门的仪器设备，限制了其在临床上的应用。目前认为实时荧光定量PCR技术是检测HBV DNA以及分型的最好方法，该技术目前被公认为第二代定量PCR技术，但其定量需要参考标品、标准曲线和内标校正，对有限的标本材料以及低拷贝数HBV的准确定量仍存在一定的应用限制。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题是：如何提供一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒及其检测方法，用于克服现有检测技术中步骤繁杂、耗时较长、易导致交叉杂交反应、需要进行定量矫正、准确度不高等不足之处，且具有准确度高、灵敏度高、精确度高、重现性好的特点。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种用于检测HBV-B/C的数字PCR绝对定量分型检测试剂盒，包括DNA提取液、数字PCR反应缓冲液A、数字PCR反应缓冲液B、HBV-B病毒基因阳性质控、HBV-C病毒基因阳性质控、阴性质控和内标溶液；