[发明专利]不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方 法。

背景技术

人类肠道病毒（humanenterovirus，HEV）属于小RNA病毒科肠道病毒属，根据目前 的分类法将肠道病毒主要分为四群：人类肠道病毒A、B、C和D群，共有100多血清型，其中A群 包括柯萨奇病毒A组（Coxsackievirus，CV-A）中CV-A2～8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV- A16，EV-A71，CV-A76、CV-A89-CV-A92和CV-A119；B群包括所有ECHO病毒（echoviruses，E-） 和柯萨奇病毒B组（CV-B），还有CV-A9以及EV-B69、EV-B73-B75、EV-B77-88、EV-B93、EV- B97-98、EV-B100-101、EV-B106-107和EV-B110；C群包括CV-A1,CV-A11,CV-A13,CV-A17, CV-A19-CV-A22，CV-A24,EV-C95,EV-C96,EV-C99,EV-C102,EV-C104,EV-C105,EV- C109,EV-C116-EV-C118,Polio1-3；D群包括EV-D68、EV-D70、EV-D94、EV-D111和EV- D120。

现有技术获得一个病毒全基因组序列，首先要通过中和试验或RT-PCR扩增其VP1 基因，明确肠道病毒的血清型，再根据其血清型原型株的核苷酸序列设计引物，分6-7片段 分别扩增和测序。这种方法用于扩增其它病毒全基因组（如流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒 等，这些病毒血清型只有一个）能获得较佳结果，肠道病毒因为血清型众多，不同血清型之 间的核苷酸差异较大，而且相同血清型之间差异也较大，另外，肠道病毒还普遍存在重组事 件，传统方法用于肠道病毒全基因组序列扩增比较困难，扩增时间往往长达3-6个月，费时 费力，工作量非常大，费用高。

肠道病毒是引起多种疾病如手足口病、病毒性脑炎、心肌炎等的病原体，又是RNA 病毒，基因变异较快，现有的基因组扩增方法不能满足需要，非常有必要改进肠道病毒全基 因组序列的扩增方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上所述缺陷，提供一种扩增速度快、方法简 单易行的不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方法。

为了解决以上所述技术问题，本发明所述不同肠道病毒血清型全基因组的扩增方 法包括以下步骤：

（1）提取病毒RNA，利用肠道病毒通用引物222－224对病毒RNA的VP1区进行RT-PCR扩 增，然后用1％的琼脂糖凝胶、电压120V进行电泳检测，检测结果与预测结果相近，对扩增所 得核苷酸目的条带进行测序，并进行NCBIBLAST比对，如果该质询序列与GenBank数据库中 肠道病毒参考株核苷酸序列同源性大于75%，即认为是同一血清型，同时即获得所述病毒 VP1区基因的核苷酸序列；

（2）利用肠道病毒5’UTR和3’UTR的保守性，针对肠道病毒全基因组设计一条首端上游 引物EV1F（5’TTAAAACAGCCTGTGGGTTG3’）和一条尾端下游引物EV8R（5’ CACCGAATGCGGAGAATTTA3’），再根据步骤（1）扩增所得所述病毒的VP1区实际核苷酸序列， 设计一条所述首端上游引物EV1F的配对下游引物EV2R和一条所述尾端下游引物EV8R的配 对上游引物EV3F，然后分别以EV1F-EV2R和EV3F-EV8R进行RT-PCR扩增，其产物用1％的琼 脂糖凝胶，120V进行电泳检测，紫外凝胶成像仪检测结果若有接近2400bp和5000bp的电泳 条带即与预期结果相符，扩增结束，并用相对应扩增引物进行测序；

（3）测序、拼接和整理根据步骤（2）所得核苷酸序列再设计测序引物进行测序，直到 获得整个基因组核苷酸序列。