[发明专利]一种用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种用于NK细胞体外扩增的培养基及 NK细胞体外扩增的方法。

背景技术

自然杀伤细胞(Naturalkillercell，NK)是机体重要的免疫细胞，在抗肿瘤 和抗病毒感染免疫中起着重要作用。由于NK细胞杀伤活性无MHC限值，因此 称为自然杀伤细胞。NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自 身组织细胞(如血细胞)及寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免 疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用 前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治疗制剂。人体 体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性：利用肿瘤细胞系的方法， 确认其对血液系统肿瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿 瘤和皮肤癌等均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了 其临床及非临床的治疗效果。2009年，NK细胞治疗技术就已列入国家三类医 疗技术目录。

充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。由于 人外周血中NK细胞含量很少(约占淋巴细胞的5～10％)，从外周血中分离NK 细胞成本昂贵，而且分离的NK细胞一般都处于非活化状态，在很大程度上限 制了其在临床上应用。要达到治疗效果，所需的有效NK细胞数量单一批次应 用至少要5×10⁹个(且纯度达到80％以上)，目前有报道的采用无血清培养体系， 通过IL-2、IL-21及相关组合因子刺激培养均不能实现NK细胞的高活性、高纯 度和高扩增倍数，其扩增能力最多达到300倍，临床应用存在安全风险。通过 自体血清培养体系实现规模扩增，且获得单一培养体系、单批次扩增的细胞数 量大于1×10¹⁰个NK细胞，且纯度大于90％的未见报道。

CN102586185A公开了一种K562细胞扩增激活NK细胞的方法，具体为 使用跨膜IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137转染的K562细胞和低浓度白 介素2共同作用定向扩增激活自然杀伤细胞的方法，该发明是以K562细胞系转 录稳定表达CD8α-白介素21、CD14、CD19、CD86和CD137的表达载体，CD8α 为在细胞膜上表达的膜蛋白，CD8α基因连接白介素21基因后使得白介素21表 达在细胞膜上，成为跨膜蛋白；然后培养K562细胞一段时间，最后经物理、化 学方式得到纯化的K562细胞，再对NK细胞进行培养。CN102268405B公开 了一种自体NK细胞体外活化扩增培养的方法及其专用培养基。该方法是利用 如下成套培养基并同时添加饲养细胞体外活化扩增自体NK细胞：由培养基1、 培养基2和培养基3组成的成套培养基；所述培养基1是在干细胞生长培养基 中添加人白细胞介素2、人白细胞介素12、人白细胞介素15、人白细胞介素18、 植物血凝素、抗人T细胞CD3单克隆抗体和离体的人血浆得到的液体培养基； 所述培养基2与所述培养基1相比，所述培养基2中无所述植物血凝素和所述 抗人T细胞CD3单克隆抗体，其它成分均与所述培养基1的相同；所述培养基 3与所述培养基2相比，所述培养基3将所述培养基2中的所述离体的人血浆替 换为离体的人AB血清，其它成分均与所述培养基2的相同。CN103849599A 公开了一种高效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法。所述培养基内含有白 细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介 素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和抗CD3抗体，可以高效扩增和活化 NK细胞，从而获得大量高活性的以NK细胞为主的免疫细胞回输人体，在抗肿 瘤、抗病毒感染和免疫调节相关疾病的治疗中具有显著疗效。根据本发明的高 效扩增自体NK细胞的培养基及培养方法，其由细胞培养用培养基和添加于所 述细胞培养用培养基的添加因子构成，用于大量培养扩增自体活化的NK细胞， 其特征在于，所述添加因子包含有白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素15(IL-15)、 白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和抗 CD3抗体。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种杀伤能力大于90％的新型的用于NK细胞 体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；

本发明的目的之二在于提供一种培养规模达到20L且可平行放大用于规模 化生产的用于NK细胞体外扩增的培养基及NK细胞体外扩增的方法；