[发明专利]构建DNA文库的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种构建DNA文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

酶试剂，所述酶试剂包括第一酶混液、T4 DNA连接酶以及第二酶混液，所述第一酶混液由T4多聚核酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段以及rTaq酶混合而成；所述第二酶混液为2XKAPA HiFi HotStart预混液；

缓冲液，所述缓冲液包括所述第一酶混液所对应的第一缓冲液和所述T4 DNA连接酶所对应的第二缓冲液，所述第一缓冲液由10X T4 DNA连接酶缓冲液、dNTP混合液以及ATP混合而成；所述第二缓冲液由ATP、Tris-HCl、MgCl₂、PEG8000、Tween 20以及二硫苏糖醇混合而成；以及

接头组合，所述接头组合包括接头序列组和标签序列组；

所述第一酶混液中，所述T4多聚核酸激酶的工作浓度为0.05～0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.02～0.04U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.01～0.03U/μL，所述rTaq酶的工作浓度为0.02～0.04U/μL；

所述第一缓冲液中，所述10X T4 DNA连接酶缓冲液的工作浓度为0.8X～2X，所述dNTP混合液的工作浓度0.3～0.6mM；所述ATP的工作浓度为1.5～2.2mM；

所述第二缓冲液中，所述ATP的工作浓度为1.5～3mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.04～0.08M，所述MgCl₂的工作浓度为0.01～0.03M，所述PEG8000的工作浓度为5wt％～10wt％，所述Tween 20的工作浓度为1v％～4v％，所述二硫苏糖醇的工作浓度为0.001～0.003M；

所述T4 DNA连接酶的工作浓度为200～800U/μL；所述2X KAPA HiFi HotStart预混液的工作浓度为1X。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述接头组合形成Y型接头。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述接头序列组由第一接头序列和第二接头序列按照等摩尔比混合而成，所述标签序列组由标签序列与通用引物按照等摩尔比混合而成。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，

所述第一接头序列为SEQ ID NO：1所示的GATCGGAAGAGCNNNNNNNNGAACTCCAGTCAC，所述第二接头序列为：SEQ ID NO：2所示的ACACTCTTTCCCNNNNNNNNGCTCTTCCGATCT，所述SEQ IDNO:1和所述SEQ ID NO：2中的N为A、T、C或G中的任何一种；

所述标签序列包括SEQ ID NO：3所示的第一标签序列、SEQ ID NO：4所示的第二标签序、SEQ ID NO：5所示的第三标签序列、SEQ ID NO：6所示的第四标签序列、SEQ ID NO：7所示的第五标签序列、SEQ ID NO：8所示的第六标签序列、SEQ ID NO：9所示的第七标签序列、SEQ ID NO：10所示的第八标签序列、SEQ ID NO：11所示的第九标签序列以及SEQ ID NO：12所示的第十标签序列；

所述通用引物为SEQ ID NO：13所示的序列。

5.一种利用权利要求1至4中任一项所述的试剂盒构建DNA文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

对样本的基因组DNA进行片段化，得到DNA片段；

利用所述第一酶混液和所述第一缓冲液对所述DNA片段进行末端修复及加A，得到修复片段；

利用所述T4DNA连接酶、所述第二缓冲液以及所述接头引物组对所述修复片段进行接头连接，得到带接头片段；

利用所述第二酶混液和所述标签序列组对所述带接头片段进行PCR富集，得到所述DNA文库。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在得到所述带接头片段的步骤后，以及在对所述带接头片段进行PCR富集之前，所述方法还包括对所述带接头片段进行纯化的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化的步骤包括依次进行磁珠纯化和电泳纯化的步骤。