[发明专利]甲基营养酵母菌巴斯德毕赤酵母中的体内非天然氨基酸表达

权利要求书

1.一种甲基营养酵母细胞，其包含：

a)非天然氨基酸；

b)正交氨酰-tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS在甲基营养酵母细胞中优先用非天然 氨基酸氨酰化正交tRNA(O-tRNA)，并且，所述O-RS由整合入基因组的核酸在FLD1启动子的 转录调控下表达，该核酸包含编码所述O-RS的多核苷酸；和

c)正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA在甲基营养酵母细胞中识别选择者密码子并优 先被所述O-RS用非天然氨基酸氨酰化，并且，所述O-tRNA由整合入基因组的核酸表达，所述 O-RS和所述O-tRNA由同一质粒上的表达盒编码且稳定整合到细胞基因组的ARG4基因，该核 酸包含编码或包含所述O-tRNA的多核苷酸；并且

所述O-RS和O-tRNA衍生自大肠杆菌。

2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述非天然氨基酸包括：对-(炔丙基氧基)苯 丙氨酸、对-甲氧基苯丙氨酸、丹酰基丙氨酸、DMNB-丝氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘 基)丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、O-炔丙基-L-酪氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L- 苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷 酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-碘-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯 丙氨酸、酪氨酸的非天然类似物；谷氨酰胺的非天然类似物；苯丙氨酸的非天然类似物；丝 氨酸的非天然类似物；苏氨酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰 肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼化物、磷、膦酰基、膦、杂 环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮或氨基取代的氨基酸，或其任何组合；带有光活化交联剂的氨基 酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；带有新型官能团的氨基酸；与另一分子共价或非共价 相互作用的氨基酸；结合金属的氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光束缚的和/或光 敏异构化的氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化或糖修饰的氨基酸；含酮氨 基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学裂解或可光裂解的氨基 酸；带有延长侧链的氨基酸；含有毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸 等；含碳连接的糖的氨基酸；糖取代的半胱氨酸；具有氧化还原活性的氨基酸；含α-羟基的 酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α,α二取代氨基酸；β-氨基酸；硫代酪氨酸；4-溴苯丙氨酸；或脯 氨酸之外的环状氨基酸。

3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，从高水平的组成型启动子表达所述O-tRNA。

4.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述启动子包括PGK1启动子。

5.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含含有编码感兴趣多肽的多核苷 酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述O-tRNA所识别的选择者密码子。