[发明专利]一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：

1)重组质粒pET-ClfA-A的构建

提取金黄色葡萄球菌DNA，根据GenBank上已提交的ClfA基因序列，分别设计上游引物与下游引物，且向上游引物与下游引物中分别引入Bam H I和Hind III酶切位点，制得重组质粒pET-ClfA-A；

上游引物P1序列如SEQ ID NO：1所示，

下游引物P2序列如SEQ ID NO：2所示，

然后对重组质粒pET-ClfA-A进行PCR扩增，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经蓝白斑筛选及双酶切鉴定得到的阳性克隆进行序列测定分析；

2)诱导的表达产物

将上述重组质粒pET-ClfA-A转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为0.8-1.2mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测；

3)目的蛋白的大量表达及纯化

根据SDS-PAGE检测确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，对目的蛋白进行大量表达和纯化；

4)免疫动物的筛选

选取体重2～2.5kg家兔，免疫后采血获取血清，进行检测；

5)免疫程序：

首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射650-750μg上述目的蛋白，背部皮下多点注射；

首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔250-350μg目的蛋白，第3次免疫后第10d采血获取血清，测定抗体效价后，制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。

2.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法， 其特征在于，PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s、62℃45s、72℃1min 30s，35个循环；72℃10min。

3.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中IPT6的终浓度为1.0mM。

4.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，首次免疫：目的蛋白与弗氏完全佐剂乳化后免疫家兔，每只家兔注射700μg目的蛋白。

5.根据权利要求1所述的ClfA-A靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于，首次免疫后每隔15d加强免疫一次，以弗氏不完全佐剂为佐剂，每只家兔300μg目的蛋白。

6.根据权利要求1-5任一所述的制备方法制得金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗。