[发明专利]一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测牡蛎疱疹病毒的巢式PCR引物组，其特征在于，所述的 引物组的信息如下：

Pol-F：5＇-GATTTCAACTCGCAATACC-3＇、

Pol-R：5＇-GGCAGACACAGATTCCACA-3＇、

nPol-F：5＇-GTGTTTCTACATTGCTGG-3＇、

nPol-R：5＇-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3＇。

2.权利要求1所述的巢式PCR引物组在制备检测牡蛎疱疹病毒的制 品中的应用。

3.一种检测牡蛎疱疹病毒的方法，其特征在于，所述的方法使用权 利要求1所述的巢式PCR引物组。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法首先从待检 测样品中制备反应模板，并配制巢式PCR反应体系，然后通过巢式PCR 反应程序对反应模板进行扩增，最后根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳是否产 生目的条带对检测结果进行判断，如果显示目的条带则表示该样品的牡蛎 疱疹病毒检测结果为阳性。

5.如权利要求4所述的方法，包含有如下的步骤：

1)基因组DNA提取：采用普通动物组织的DNA提取方法，从待检 测的样品中提取DNA；

2)第一轮PCR扩增：

以步骤1)中得到的样本DNA为模板，采用Pol-F/Pol-R引物，经PCR 扩增得到第一轮PCR扩增产物；

3)第二轮PCR扩增：

以第一轮PCR扩增产物10倍稀释物为模板，采用nPol-F/nPol-R引 物，经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物；

4)PCR扩增产物检测：

取第二轮PCR扩增产物进行电泳，如存在386bp的特异性条带，则 确定所检测的样本被OsHV-1所感染。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)所用PCR 反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs (2.5mmol/L)4.0μL，Mg²⁺(25mmol/L)4.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水30.6μL补齐到50μL的反应体 系。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)所用PCR 反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，53℃变性30 s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)所用PCR 反应体系为：DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，10×PCRbuffer5.0μL，dNTPs (2.5mmol/L)3.0μL，Mg²⁺(25.0mmol/L)3.0μL，上下游引物(10.0μmol/L) 各2.0μL，DNA模板2.0μL，另外加超纯水32.6μL补齐到50μL的反应体 系。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)所用PCR 反应程序为：首先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，51℃变性30 s，72℃延伸45s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。