[发明专利]一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用

说明书

本发明涉及一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825。所述系统应用于酿酒酵母的等位基因高效整合，整合方法包括：构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质粒；将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到质粒的整合卡盒中；将整合卡盒释放或扩增出来，转入基因敲除背景或者非基因敲除背景的酿酒酵母菌株中，筛选鉴定整合效果。本发明高效、便捷、高通量、适用范围更广的等位基因整合方法；尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基因整合。

技术领域

本发明属于遗传学领域中的酵母等位基因整合技术领域，特别涉及一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用。

背景技术

随着质谱技术(mass spectrometry)的进步，使得我们能够利用质谱快速、高通量的鉴定基因的转录、修饰。而对与基因进行功能分析则需要对无修饰和(或)模拟修饰的等位基因突变体进行表型鉴定。对于酿酒酵母，这种等位基因可以通过携带相应的缺失或条件性等位基因的着丝粒质粒来进行分析。然而，为了避免质粒携带等位基因时因拷贝数量和(或)错误转录调控激活而引起的潜在问题，有时从原基因座上表达整合的等位基因更合适。

一些有关整合或敲除酵母基因座上等位基因的方法已有报道。其中的大多数方法都需要在基等位基因整合后剔除一个选择性或反向选择性的筛选标记。这使得以通过高通量分析基因间相互作用来研究基因功能为专长的技术如合成遗传阵列(syntheticgenetic array，SGA)和基于基因芯片的合成致死阵列分析(diploid based syntheticlethality analysis on microarrays，dSLAM)变得无所适从。虽然PCR介导的标记融合方法能通过选择性标记来产生等位基因整合，但是由于基因的异质性和相对较低的整合效率，特别是这些标记距离等位基因突变位置相对较远使得高通量基因研究难以进行。

最近，二倍体重组技术的兴起使该问题得以解决，二倍体重组技术是一种实用性强的技术，可用于基因敲除背景下的酵母等位基因整合。但该技术需要一些关键组件——整合卡盒，这种卡盒的5’和3’端各具有一半的KanMX模块，中间的含有靶基因(AOI)的侧翼序列和作为筛选标记的URA3。整个卡盒通过基因克隆技术克隆到TOPO克隆载体中，随后通过酶切将卡盒从TOPO克隆中释放出来。随着卡盒被转化至基因敲除背景下的酵母菌株(AOI/aoiΔ::kanMX)中，AOI及URA3替换AOI基因座上的KanMX序列，使突变菌株具备URA⁺同时丧失kan抗性，从而获得等位基因整合菌株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用，该质粒系统用于酿酒酵母等位基因高效整合高效、便捷、高通量、适用范围更广。

本发明的一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统，所述系统包括4种不同的酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825；其中，pDH735携带的整合卡盒为：pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF；pDH818携带的整合卡盒为：pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pTRP1-kan-tTEF；pDH824携带的整合卡盒为：pTEF-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF；pDH825携带的整合卡盒为：pT-attP1-ccdB-CAT-attP2-pADH1-nat-tTEF。