[发明专利]一种荧光共振能量转移多成分荧光寿命估计方法

说明书

本发明涉及一种荧光共振能量转移多成分荧光寿命估计方法，测量荧光共振能量转移时各个像素点的平均荧光寿命。首先将时间相关单光子计数输出的直方图数据进行组合形成区间较少的新直方图，以消除部分噪声的影响并能大大减小算法运算量。对新直方图区间数据进行自相关运算并对自相关矩阵进行平滑处理。对其自相关矩阵进行特征值分解，获得信号子空间。对信号子空间进行矩阵分割，形成两个矩阵，两个矩阵通过旋转矩阵进行变换。获得旋转矩阵的特征值后，通过运算得到平均荧光寿命的估计。本方法在不需要分量个数及大致组分含量和大致荧光寿命信息，通过两次矩阵特征值分解及简单变换，就可以直接估计出平均荧光寿命信息。

技术领域

本发明是一种荧光共振能量转移多成分荧光寿命估计方法，实现的主要功能是测量荧光共振能量转移时各个像素点的平均荧光寿命。

背景技术

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强。FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。

荧光能量共振转移可以通过时间相关单光子计数技术（TCSPC）进行测量，由于TCSPC系统输出直方图对应的光子个数受漂白的影响，不能太大，且SPAD采集到的各个像素点数据中，有的地方只包含供体的荧光寿命，有的地方则发生了荧光能量共振转移而包含多个荧光寿命。在荧光寿命成像中，平均荧光寿命是一个重要的参数，因此获得平均荧光寿命具有重要意义。由于光子个数有限，通过测量出受体和供体的荧光参数，再根据含量信息来测算出平均荧光寿命不太可能。目前在荧光寿命估计算法上，通常用数据拟合方法。由于拟合方法运算量巨大，且很容易收敛到局部极值，而且需要实现知道每个像素点对应的荧光寿命的个数，这在试验中是不可能的，造成估计结果可信度较差，而且多使用尝试的方法，使用多种模型进行计算，再对结果进行分析。最近几年发展出了Prony方法、IEM方法、CMM方法、Phasor方法等运算量较小方法，但这些方法大都适用于单组分，对于多组分，还是需要采用拟合方法进行技算，且部分算法采用近似的方法，估计结果存在偏差，需要对结果进行校正。

发明内容

为解决上述问题，本发明特提出一种荧光共振能量转移多成分荧光寿命估计方法，测量荧光共振能量转移时各个像素点的平均荧光寿命。在分析荧光能量共振转移特点和TCSPC数学模型基础上，有效利用数据，不需要分量个数及大致组分含量和大致荧光寿命信息，通过两次矩阵特征值分解及简单变换，就可以直接估计出平均荧光寿命信息。

首先将时间相关单光子计数（TCSPC）输出的直方图数据进行组合形成区间较少的新直方图，以消除部分噪声的影响并能大大减小算法运算量。对新直方图区间数据进行自相关运算并对自相关矩阵进行平滑处理。对其自相关矩阵进行特征值分解，获得信号子空间。对信号子空间进行矩阵分割，形成两个具有旋转关系的矩阵，两个矩阵可以通过旋转矩阵进行变换。获得旋转矩阵的特征值后，通过简单的运算可以得到平均荧光寿命的估计。根据荧光共振能量转移及TCSPC系统的特点，我们采用一维信号子空间，可以直接得到各个像素点的平均荧光寿命估计。便于后续荧光寿命成像系统（FLIM）进行图像处理。

假设共有种组分，TCSPC在某一连续时刻输出的数据可以建模如下

,

其中为第个组分的含量，为第个组分的荧光寿命，为加性散粒噪声。

对上式时间离散化，得到

其中为采样时间，m表示第m次采样。

则在TCSPC输出的直方图中第个区间的输出数据为