[发明专利]一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

内生菌是指一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。研究表明，内生菌的用途非常广泛，在农业生产方面，人们利用内生菌来增强其宿主的抗逆性，抗虫害，促进植物的生长，增强宿主植物的环境适应能力，避免宿主受到迫害，这样既减少了化学农药的大面积污染，又保证了农作物的天然性。在医学方面，从内生菌中寻找更多抗癌和抗病的基因也成为现在的研究热点。在工业方面，内生菌产生的某些活性物质，如具有抗性的特殊的酶类，在工业上也具有较大的应用潜力。

一般情况下，内生真菌与宿主是以互惠的方式进行共生，所以通常认为两者是互利共生的关系。一方面，宿主植物为寄生的内生真菌提供生存环境和生长必须的养分；另一方面，内生真菌会产生有利于宿主植物生长和发育的次级代谢产物，这些代谢产物在宿主植物应对抗病虫害、抗旱和对病原体的拮抗时发挥了重要作用。

迄今为止已被发现的内生真菌包括接合菌、卵菌、担子菌、子囊菌、有丝分裂孢子真菌和其无孢菌等多种菌群，其中曲霉属、镰孢霉属和拟茎点霉属为较优势的菌种。而从耐盐植物种直接分离棘孢木霉还属于空白。

植物在逆境下产生的大量逆境乙烯阻碍其正常生长发育，严重时可导致植株死亡。ACC脱氨酶可将植物乙烯合成的直接前体ACC水解为α-酮丁酸和氨，阻止植物内体乙烯的过量产生，有效促进逆境下植物的正常生长发育及延缓植物组织的衰老。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉及其应用，该棘孢木霉具有很高的ACC脱氨酶活性，能够促进海滨锦葵和大豆幼苗的生长，增加其生物量、含水量和叶绿素含量。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是提供一株高产ACC脱氨酶的棘孢木霉，所述棘孢木霉为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)KpS，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015770，保藏日期：2015年12月23日。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种高产ACC脱氨酶的棘孢木霉的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)将海滨锦葵块根去皮、消毒并切块，然后接种于PDA平板上培养，将培养出的菌种进行分离纯化；

(2)将分离纯化的菌种接种于PDA平板上，继续培养，挑选真菌并进行筛选；

(3)将步骤(2)筛选的真菌进行基因组DNA提取，并连入T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选单克隆，进行PCR检测并测序，得到棘孢木霉。

步骤(1)和(2)培养的温度是25-28℃，时间是3-5d。

本发明所采用的技术方案还在于提供一种高产ACC脱氨酶的棘孢木霉在促进植物生长方面的应用。

本发明有益效果

1、本发明首次从盐生植物海滨锦葵块根中分离出棘孢木霉，该棘孢木霉的ACC脱氨酶活性较高，能够通过降解乙烯合成前体，从而减少植物合成乙烯，间接提高生长素和乙烯的比例，促进植物的生长。

2、本发明从海滨锦葵块根中分离内生真菌，并将分离纯化的内生真菌接种在ADF平板上，筛选得到10种海滨锦葵内生真菌，通过高通量比色法和2,4-二硝基苯肼比色法，最终筛选得到菌株KpS，结合显微镜观察菌落、孢子观察及测序结果，确认菌株KpS为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)。实验表明，本发明最终筛选的棘孢木霉KpS在ADF平板上的ACC脱氨酶活性可达4557.92nMαKBmg^-1h^-1，高于其它几种海滨锦葵块根内生真菌，甚至是其中绝大多数内生真菌的几倍甚至是十几倍。

3、本发明的棘孢木霉KpS接种海滨锦葵根系后，能够增强海滨锦葵的耐盐性，在高盐条件下，显著提高海滨锦葵叶绿素含量，使海滨锦葵的叶片生长加快，叶片增厚，能够减少水分蒸腾，提高幼苗的含水量，增加了海滨锦葵幼苗的干重和鲜重。

4、本发明克隆了棘孢木霉KpS的acdS基因，构建含有acdS基因的重组质粒，并电转化毕赤酵母，最终在甲醇的诱导下利用毕赤酵母成功表达了ACC脱氨酶，为利用酵母作为生物反应器工业化生产ACC脱氨酶提供了技术支持。该技术通过生产ACC脱氨酶，利用ACC脱氨酶增强植物的耐盐性。