[发明专利]一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法

说明书

技术领域

本发明属于荧光辅助糖电泳技术领域，具体涉及一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚 糖酶解产物分析检测不同木聚糖酶功能的方法。

背景技术

在木质纤维素中木聚糖是继纤维素之后最为丰富的植物细胞壁多糖，但是木聚糖的结构 组成却明显复杂于纤维素。木聚糖骨架是由木糖残基通过β-1,4糖苷键连接而成，并被L-阿 拉伯糖、葡萄糖醛酸及4-O-甲基葡萄糖醛酸等侧链糖基取代。由于木聚糖结构组成复杂，导 致对其降解利用需要复杂的酶系。降解木聚糖骨架的酶主要包括1,4-β-D-木聚糖酶、β-木糖 苷酶，侧链的去除主要由L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-D-葡萄糖醛酸酶等完成。在木聚糖降解酶 系中，1,4-β-D-木聚糖酶在将木聚糖降解为木寡糖中发挥着重要的作用，降解产生的木寡糖 可以在β-木糖苷酶的作用下完全转化成木糖。木寡糖已于2008年被中国卫生部批准为新功 能性食品(2008，卫生部)，它具有高效、稳定、安全、无毒等优点，因此越来越多地被用 于食品、饲料、医药等领域。而木糖在生物燃料的生产中具有重要应用价值。1,4-β-D-木聚 糖酶的功能差异及与β-木糖苷酶的比例决定着木寡糖的种类及木糖的产量。农业废弃物玉 米芯中含有丰富的可利用木聚糖，通过不同酶系的作用可以产生不同种类价值的产品，因此， 快速确定不同木聚糖酶的功能差异及酶系中酶与酶之间的协同对复配特定的降解酶系用于 不同的生产需求具有重要意义。

木聚糖酶的功能差异主要通过酶解产物反映，目前，对于木聚糖的复杂酶解产物，特别 是低聚木糖尚缺乏快速、灵敏和可定量的分析方法。常用的方法有薄层层析(TLC)技术、 高效液相色谱(HPLC)法等。TLC检测过程中容易使复杂样品扩散、拖尾从而影响分离和 定量结果，而HPLC对糖的检测灵敏度不高，尤其是对木寡糖的分离效果不佳。荧光辅助糖 电泳(FACE)使用荧光基团标记单糖、寡糖和多糖还原端，8-萘胺-1,3,6-三磺酸(ANTS) 和7-萘胺-1,6-二磺酸(ANDS)经常用作荧光标记物，其氨基基团可以与糖环呈打开状态的 单糖或寡糖形成席夫碱，再经过一种合适的还原剂(NaCNBH₃)还原，使荧光标记物的耦 合变为不可逆反应，使木聚糖酶解产物可以在凝胶上得以有效的分离，并通过灵敏的荧光成 像系统进行鉴定分析。但检索发现有关利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴 定不同木聚糖酶功能的方法还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木 聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能的方法。

本发明所述利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析鉴定不同木聚糖酶功能 的方法，步骤是：

(1)利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉，获得玉米芯木聚糖；

(2)用不同待鉴定木聚糖酶对玉米芯木聚糖实施酶解；

(3)利用荧光辅助糖电泳对玉米芯木聚糖酶解产物分析；

(4)根据对玉米芯木聚糖酶解产物分析结果判定待鉴定木聚糖酶功能的差异；

其特征在于：

步骤(1)所述利用玉米芯制备粒径均一超细的玉米芯木聚糖粉的方法是：

①将烘干后的玉米芯粉碎成粒径为0.2±0.1mm的颗粒，过80目筛子，获得粒径均一 的玉米芯粉；

②将制得的粒径均一的玉米芯粉按质量体积比1:8-9的比例加入蒸馏水，于105±2℃ 预处理40-50min，然后用8层纱布过滤，收集滤渣；

③将滤渣烘干后研磨1-2h；

④研磨后加入与①所述蒸馏水体积相同量的浓度为15％(w/v)的氢氧化钠溶液，于 115±2℃下蒸煮40-50min,然后用8层纱布过滤，收集滤液；

⑤滤液用浓度为30％(w/v)的氢氧化钠溶液对其进行脱色处理0.5-1h；

⑥脱色处理后的溶液用浓度为15％(w/v)的三氯乙酸溶液脱蛋白，其中所述溶液与 三氯乙酸溶液的体积比为8:1；

⑦将脱蛋白后的溶液以8000r/min离心30min，收集上清液，然后加入浓盐酸将该溶 液的pH调至6.0；

⑧加入⑦制得的溶液3倍体积量的无水乙醇，醇沉12-20h，然后8000r/min离心20 min，收集的沉淀物即为木聚糖粗提物；