[发明专利]二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒

说明书

本发明涉及一种接头序列，其选自SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：20中的至少两条。本发明还涉及到一种标签接头，其由接头序列以及DNA标签序列组成。本发明还公开了一种接头PCR引物组，每条接头PCR引物由上述的标签接头以及连接于标签接头3’端的连接序列构成，所述连接序列可将标签接头直接添加到目标基因片段的两端，从而构建测序文库。本发明提供的接头PCR引物，能够一次性在目标基因片段两端加上测序接头、样品标签和扩增引物，随后通过PCR富集即可得到测序文库，从而避免了常规建库过程中基因组DNA打断、纯化、末端修复、纯化、加A尾、纯化和接头连接的步骤，避免了反复多次操作及接头连接效率等诸多不稳定因素对构建文库质量的影响，大大提高了检测准确率。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及二代测序样品前处理的引物和方法以及试剂盒。

技术背景

随着分子生物学、遗传学等学科的发展，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术应运而生。第二代测序技术也称深度测序、大规模平行测序，其核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，synthesis)，例如，在合成新DNA互补链时，加入的dNTP通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，或者直接加入被荧光标记的dNTP或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号，通过荧光信号分析获得互加入碱基信息。现有的技术平台主要包括Roche的454平台、Illumina公司的Solexa GenomeAnalyzer、Applied Biosystems的SOLID system以及life technologies的PGM平台。二代测序是一项新的低成本，高通量，高准确度的快速测序技术，在科学研究和临床检测方面都有着广泛的应用。

无论何种测序平台在测序前都要对样本进行处理，建立基因文库。不同的测序平台基因文库构建方法会有些差异，但基本可概括为以下几个步骤：获取基因组DNA，基因组DNA片段化，末端修复，连接接头，DNA片段选择，PCR扩增，扩增产物鉴定回收及纯化，纯化产物大小和浓度测定，符合要求的基因文库根据不同的测序平台要求制备测序模板，随后进行测序。常规的建库方法都需要较高浓度的起始核酸量，且操作步骤繁琐，需要经过预处理才能将测序接头连接到目的基因片段上，随后进行PCR扩增富集，费时费力，且接头连接效率直接影响构建文库的质量，所以并不适用于大规模临床样本及微量核酸样本的快速建库。因此，迫切需要一种能够简便、高效、快速和准确的建库方法，不仅适用于足量核酸样本的快速建库，同时可对特定的少量细胞群样本进行测序和突变分析，如特殊区域肿瘤组织细胞或血液中的循环肿瘤细胞等。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种接头序列，该接头序列可与包括但不限于扩增目标基因片段的引物以及转座子识别序列连接，可以通过PCR扩增或转座酶复合体直接添加到目标基因 片段的两端，构建测序文库。

实现上述目的的技术方案如下：

一种接头序列，其选自SEQ ID NO：1—SEQ ID NO：20中的至少两条。

本发明的另一目的是提供一种标签接头。

实现上述目的的技术方案如下：

一种标签接头，包括正向标签接头和反向标签接头，针对同一样品来源的标签接头包括有正向标签接头和反向标签接头，每条标签接头由5’的权利要求1所述的接头序列以及3’的用于表征样本来源的DNA标签序列组成，针对同一样品来源的标签接头中的接头序列不相同，同一样品来源的目标基因片段对应的DNA标签序列相同，且DNA标签序列中避免出现3个或3个以上单碱基重复序列；其GC含量在40％～60％之间；不同的DNA标签序列之间不存在非特异性结合；DNA标签与接头序列组合成标签接头后，内部不存在发卡结构或二聚体等二级结构；DNA标签中不出现与接头序列相似度大于80％的序列。