[发明专利]一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法

说明书

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法及其应用。本发明主要是利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c‑kit‑1)修饰于金电极表面，经处理使c‑kit‑1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，即可促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR)；利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，通过电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过电化学信号与PARP浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的电化学信号，通过计算即可实现PARP的灵敏检测。该方法具有好的重复性，高的灵敏度，可应用于PARP及其抑制剂3‑氨基苯甲酰胺(3‑AB)的检测。

技术领域

本发明涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法，特别是一种PARP检测的电化学方法，属于分析化学领域。

背景技术

多聚腺苷二磷酸核糖基化是由PARP家族所催化的一类必不可少的蛋白质翻译后修饰过程。在该过程中，PARP由特定的DNA激活，对底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)进行切割，使其裂解成为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖(ADP核糖)，并将后者聚合至受体蛋白，通过若干重复反应，即可形成一个线性或分枝结构的ADP-核糖聚合物(PAR)。该聚合物一般含有200个左右的ADP核糖单元，同时具有很高的电负性。人体内约90％的多聚腺苷二磷酸核糖基化修饰反应，都是由PARP所完成的，它在DNA修复、转录调控、细胞凋亡等方面起到重要作用。同时，PARP抑制剂也是有效的癌症治疗辅助药物。

现今，PARP的常见检测技术主要包括放射性免疫法、荧光法以及酶联免疫法等。这些检测方法往往需要昂贵的仪器，同时需要对催化底物进行放射性标记或酶标记。众所周知，标记过程往往是非常耗时且昂贵，甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具有设备简单，价格低廉、灵敏度高、简便快捷，同时可以实现无标记检测等优点，近年来，被成功的应用于蛋白质蛋白糖基化和磷酸化等后修饰过程的检测。

发明内容

本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势，建立一种简单、无需标记且成本低廉，同时又具有高灵敏度的PARP检测方法。

本发明的技术方案：一种PARP的电化学检测方法，利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-1)修饰于金电极表面，经处理使c-kit-1形成四聚体构型；与PARP孵育后，加入该酶特定的催化底物NAD，促使PARP发生自催化产生一条带有高负电荷的聚ADP核糖(PAR)；利用PAR的高负电性吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex)，利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量，通过制定标准曲线，即可实现PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵敏检测。

方法包括以下步骤：金电极的预处理、c-kit-1修饰电极的组装、样品与修饰电极的孵育和酶催化、PARP的电化学检测。

(1)金电极的预处理

采用经典的预处理方式进行金电极的预处理。具体步骤如下：用1微米、0.3微米的三氧化二粉末分别对直径为3mm金圆盘电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超声5分钟。清洗之后将金电极分别置于水虎鱼(浓硫酸∶H₂O₂的体积比＝3∶1)和50％的硝酸溶液中浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5M H₂SO₄中，在0V-1.5V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1V/s，直至达到稳定后，用氮气吹干电极表面。

(2)c-kit-1修饰电极的组装