[发明专利]肺癌特异性转录调控元件的筛选方法

说明书

【技术领域】

本发明属于分子生物学领域，涉及基因的表达调控，具体涉及肺癌特异性转录调 控元件的筛选方法。

【背景技术】

DKK1是经典wnt信号通路的拮抗剂，它可以与Lrp5/6受体蛋白结合，对wnt信号通 路产生竞争性抑制作用。在DKK1的血清浓度检测中，与其它恶性肿瘤、良性肺疾病和健康对 照组相比，肺癌患者血清DKK1浓度明显升高，可作为一种肺癌诊断的血清标志物，但研究发 现DKK1启动子在肺癌中的活性并不是很高。真核生物基因的空间、时间特异性表达调控是 一个极其复杂的过程，参与基因转录调控的一些DNA序列称之为转录调控元件 (Transcriptionalregulatoryelements，TREs)，主要包括启动子、增强子、绝缘子等。启 动子是调控基因表达的基本元件，但是针对DKK1在肺癌中的这种高水平、特异性表达特点， 我们认为除了DKK1启动子元件外，仍需要有其他转录调控元件如增强子的协同调控DKK1的 表达。因此，对DKK1基因增强子等转录调控元件在基因组中预测及定位至关重要。

在基因组中，TREs的预测将是一个重大挑战，传统的方法是通过比较基因组学寻 找物种间同源非编码DNA保守序列。近几年，随着基因芯片技术和高通量测序技术的发展， 通过基因组范围内检测分析转录调控元件与相关的表观标志物，可以实现强有力的TRE预 测分析。在染色质中，转录调控元件区域常缺乏核小体，这种相对开放性的构象可以允许转 录调控因子与DNA序列结合，它们可以选择性被DNase消化，而其他被核小体包围的高度有 序的区域则不会被消化。利用DNaseI超敏位点检测方法结合基因芯片技术(DNase-chip) 或深度测序技术(DNase-Seq)可应用于全基因组范围进行转录调控元件的筛选和鉴定。随 着高通量测序技术的发展，结合染色质免疫共沉淀(ChIP)技术发展的ChIP-seq技术被广泛 用于全基因组转录调控因子的研究，该方法可以全基因组范围定位转录调控因子的结合 位点。DNA片段的转录调控活性验证最广泛有效的一种方式是报告基因瞬时转染的方法。在 这种方法中，将预测TRE置于荧光素酶报告基因质粒中，瞬时转染到培养细胞中。通过荧光 素酶发光强度检测，对TRE元件的活性进行分析，可以对筛选元件实现高通量分析。

除了DNA序列自身及转录调控因子外，还存在许多表观修饰信息影响基因表达调 控。这些表观调控信息主要包括：组蛋白修饰、染色质重塑、核小体变形等。其中组蛋白修饰 是表观遗传调控最重要的内容。在染色质中组蛋白N末端容易受到修饰酶的甲基化、乙酰化 等共价修饰。这种组蛋白修饰往往对基因的表达具有很大影响。不同的TRE元件具有不同的 组蛋白修饰模式，且多种组蛋白形成修饰组合协同影响基因的表达。

许多TRE在某种类型细胞或发育的某个阶段处于沉默状态，在进一步的功能验证 中无表达活性。比较基因组学、DNaseI超敏性等方法不需要相应检测抗体，而且检测较灵 敏，不能对TRE进行分类，且不能预测TRE元件的活性状态。借助ChIP-chip/seq方法可以实 现全基因组范围相关修饰物进行分析，并且可以根据鉴定的组蛋白修饰情况判断相关的 TRE类型及活性。但目前ChIP-chip/seq的分辨率较低，测序信号峰在基因组中分布范围广， 根据信号峰很难确定筛选序列的核心区域。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种肺癌特异性转录调控元件的筛选方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种肺癌特异性转录调控元件 的筛选方法，通过UCSC数据库获取非小细胞肺癌A549细胞中DKK1基因位点周围27kb长区域 的表观遗传信息，对获得的表观遗传信息进行分析预测得到12条候选增强子转录调控元件 片段，接着将这12条选增强子转录调控元件片段分别插入到DKK1近端启动子上游，成功构 建荧光素酶重组质粒；所得荧光素酶重组质粒分别转染到非小细胞肺癌A549细胞、非小细 胞肺癌H460细胞、小细胞肺癌H446细胞、食道癌Eca-109细胞、正常肝细胞Changliver和 人胚肾细胞HEK293，并通过双荧光素酶报告基因检测系统检验相关候选元件活性，筛选到 对DKK1启动子具有较高的增强表达作用的调控元件即所述肺癌特异性转录调控元件。

进一步地，所述表观遗传信息为DNaseI超敏性、组蛋白修饰与P300结合位点。