[发明专利]一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

单增李斯特菌是一种兼性厌氧性革兰氏阳性细菌，属于李斯特菌属。它主要以食物为传染媒介，是全球范围内的最致命的食源性病原体之一。李斯特菌在环境中分布广泛，肉类、蛋类、禽类、乳制品、蔬菜等均已被证实是李斯特菌的感染源。感染李斯特菌后会引起肌肉疼痛、恶心、腹泻等症状，严重的可引起血液和脑组织感染，而且由于该菌在4℃冷藏温度下仍可生长繁殖，被污染的冷藏食品对人类健康具有很大威胁。因此很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。

李斯特菌属共分为10个种，包括单增李斯特菌 (L.monocytogenes)、绵羊李斯特菌(L.iuanuii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔李斯特菌(L.welshimeri)等。其中单增李斯特菌是引起人类致病的主要原因。然而，作为食品卫生学的指标，李斯特菌常常被要求专门进行检测。检测李斯特菌属的方法目前主要有平板培养法、聚合酶链式反应法(PCR)、酶联免疫方法(ELISA)。

Elisa作为检测微生物的常用方法具有快速、灵敏、特异性好、高通量、不需要大型仪器，易于推广的特点。直接检测微生物的Elisa试剂盒检测抗原通常为菌体的表面抗原，检测抗体一般为多克隆抗体或单克隆抗体。由于单克隆抗体具有理化性质单一、特异性好、亲和力高并可以无限生产的特点，比多克隆抗体具有更高的应用价值。本发明制备了李斯特菌属特异性单克隆抗体并建立起李斯特菌属特异性的双抗体夹心ELISA方法，为食品中李斯特菌属的监测与控制提供了分析手段。

发明内容

(一)要解决的技术问题

李斯特菌属包括10个种，其中的单增李斯特种又分为13种亚型，种类较为繁多。如何实现对李斯特菌属的均一性、特异性检测是目前ELISA方法仍需要解决的问题。本发明的目的在于建立一种具有较高灵敏度、均一、特异性好、操作简单的ELISA方法用于检测食品中的李斯特菌属的。

(二)技术方案

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种基于单克隆抗体的检测食品中李斯特菌属的双抗体夹心ELISA法，酶标板上包被了包被抗体2G7，可特异性捕获李斯特菌属内的李斯特菌，2H8-HRP为酶标抗体，包被抗体2G7与李斯特菌结合后催化底物在450nm产生吸收值，P/N≥2.1时被判定为阳性，反之，P/N＜2.1则判定为阴性；

抗体2G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10875；

酶标抗体2H8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.10876；

步骤为：

（1）李斯特菌属单克隆抗体的制备

以原核表达的单增李斯特菌P60蛋白（Listeria monocytogenes J0161, GenBank: AEO 02672.1）为免疫原，免疫8周龄BALB/c小鼠并通过杂交瘤技术融合小鼠脾脏。免疫程序如下：第一周进行首免，80μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，80μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，40μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，检测小鼠血清对李斯特菌属及其它杂菌的交叉反应；第九周进行四免，40μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第十周检测小鼠血清对李斯特菌属及其它杂菌的交叉反应，筛选对李斯特菌属效价高，交叉均一并且对其它杂菌没有交叉的小鼠；第十二周进行冲刺免疫，20μg /只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行用常规杂交瘤技术融合小鼠脾脏。