[发明专利]一种提取纯化波形蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域的一种提取纯化波形蛋白的方法。

背景技术

波形蛋白(vimentin，Vim)为极度保守的细胞骨架Ⅲ型中间丝蛋 白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，以多聚体纤维稳定存在。 Vim单体仅溶于高离子序列溶液如尿素、阴离子表面活性剂、盐酸胍 溶液等，分子量为53kDa，等电点5.05，在pH值7.2-7.4最稳定。 Vim具有调节细胞分化、迁移、信号传导、凋亡以及自身抗原和细胞 因子特性，在感染、肿瘤、自身免疫、固有免疫等方面显现复杂的功 能，具有生物药品开发的广阔前景。

国外曾有文献报道天然Vim的纯化方法。Geisler等依次用 SephadexG-25(葡聚糖凝胶G-25)、CM-32(弱阳离子交换柱)及DE52 (弱阴离子交换柱)纯化猪晶状体中的Vim，最后得到Vim纤维丝。 Nelson等使用组织上清液中的艾氏腹水癌细胞，以DNA-纤维素层析 法得到Vim。Bioemendal等依次用SephadexG-25和PBE94(聚焦色 谱的pH梯度柱)聚焦层析法纯化牛晶状体中的Vim。DLSpector用 SephadexG-25，之后用羟基磷灰石柱在8-35mM磷酸钠浓度范围线性 洗脱分离纯化牛晶状体中的Vim。以上技术方法成本高、产量低，方 法复杂，周期长，不适于制备型应用。国内戴丽娟等曾报道从人宫颈 癌细胞中克隆Vim基因并构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组 表达质粒，以DH5α菌、BL21菌进行质粒扩增和诱导表达Vim。但未 提及纯化方法，且仍存在成本高、产量低、方法复杂、周期长的问题。 现售Vim由国外基因工程制备，价格昂贵且与天然Vim蛋白相比存在 结构缺陷。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种方法简捷、高 效、低成本的提取高纯度天然波形蛋白的方法。

技术方案包括以下步骤：

(1)粗提：解剖猪眼取晶状体，浸入粗提液后匀浆制得混悬液； 将混悬液离心后弃上清液，取沉淀物重悬数次并离心；取沉淀物冻干 制得粗提粉；

(2)精提：以精提液溶解步骤(1)中的粗提粉，离心后去沉淀， 取上清液浓缩后得到精提物溶液；

(3)分离：取精提物溶液加载到预平衡的DEAESepharoseFF柱 (二乙胺基乙基键合快流速琼脂糖凝胶弱阴离子交换柱)，先使用第 一缓冲液洗脱大部分的42kDa杂蛋白，再使用第二缓冲液进行线性洗 脱，收集馏分；

(4)纯化：对各馏分用10％SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶)电泳，做Western-Blot(免疫印迹法)实验进行蛋白成 分检测；合并53kDa目标波形蛋白含量达80％以上的馏分，经透析、 冻干即得纯化Vim粉。

所述步骤(3)中，所述第一缓冲液中含有36mMNaH₂PO₄(磷酸 二氢钠)、8M尿素、0.5mMPMSF(胆碱酯酶抑制剂)、1mg/LLeupeptin (亮抑肽酶)、1mg/LAprotinin(抑肽酶)、1mMDTT(二硫苏糖醇)， 其pH值为7.0。

所述步骤(3)中，所述第二缓冲液中含有36-86mMNaH₂PO₄、8M 尿素、0.5mMPMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT， 其pH值为7.0；进行线性洗脱时，第二缓冲液以36mMNaH₂PO₄为起始 洗脱浓度，以86mMNaH₂PO₄为终止洗脱浓度。

所述步骤(3)中，所述第二缓冲液线性洗脱参数为：流速1ml/min， 压力0.5MPa，NaH₂PO₄线性上升梯度0.5mM/1ml。

所述步骤(3)中，第一缓冲液的洗脱体积至少为40ml；控制第 二缓冲液的洗脱体积为100ml，2ml一管收集馏分。

所述步骤(2)中，精提液含有10mMNaH₂PO₄、8M尿素、0.5mMPMSF、 1mg/LLeupeptin、1mg/LAprotinin、1mMDTT，其pH值为7.0，4 ℃预冷。

有益效果：