[发明专利]淫羊藿总黄酮在干预肠道屏障功能障碍中的应用

说明书

技术领域

本发明提供一种淫羊藿总黄酮在制药中的应用，具体是在制备抑制肠道屏障功能丧失的药 物中的应用。

背景技术

衰老的一个共同特点是细胞完整性逐渐丧失，最终导致组织功能障碍及机体的死亡， 而维持能量代谢平衡、增强应激抵抗能力可延长机体寿命。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK) 是细胞内维持能量代谢稳态平衡的主要能量传感器，衰老过程中AMPK活性逐渐减弱。 近来有研究显示，AMPK可调节多条信号通路，包括增强自噬以及抗应激。研究还发现 应激抵抗因子如核因子E2相关因子(Nrf2)和长寿信号通路如FoxO3a、SIRT1又可调节 自噬。因此，AMPK可能通过联系多条信号通路网络参与调节衰老过程。

肠道是机体中最大的细菌库，而肠道的上皮完整性是营养吸收及保护肠道免受感染所 必需的。上皮屏障功能主要由相邻细胞间紧密连接蛋白所维持。大量研究报道，衰老大鼠、 果蝇肠道上皮的结构、功能出现损伤，而且果蝇的肠道屏障功能受损可以提示其机体衰老 开始。此外肠道屏障功能障碍可能会引起远远超出肠道范围的严重后果(Reraetal.,2013)。 新近研究显示，肠道是重要的靶器官之一，在线虫及果蝇肠道中通过对其基因进行干预可 延长个体寿命值得研究的是，AMPK及长寿信号通路活性减弱可调节紧密连接蛋白的表 达，参与肠道屏障功能损伤。

淫羊藿首次在神农本草经中出现报道，在中国的使用已经超过了2000年，在中国及 日本、韩国、意大利等其它国家均有广泛分布。淫羊藿总黄酮是从淫羊藿属植物分离出的 一种主要成分，具有抗炎、抗癌、心肌保护等功效，在亚洲国家广泛用于治疗衰老相关疾 病。淫羊藿总黄酮可转化为淫羊藿次苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅱ、淫羊藿苷。近来多种疾病中的 研究显示，淫羊藿次苷可抑制mTOR信号通路、上调SIRT1的表达、使Foxo3去乙酰化。 此外，已经开始有研究淫羊藿苷对肠道疾病作用的报道。我们已发表的研究显示淫羊藿总 黄酮可通过上调SOD3及GPX1而降低环磷酰胺诱导的雄性小鼠生殖系统的氧化损伤。

发明内容

本发明提供一种淫羊藿总黄酮在制备抑制肠道屏障功能丧失的药物中的应用。淫羊藿总黄 酮是通过促进抗氧化应激及长寿相关信号通路的表达而调节衰老肠道屏障功能障碍。

所述的促进抗氧化应激表达包括促进肠道claudin-1和occludin的表达。所述的促进抗氧 化应激表达还包括促进肠道P-Thr172-AMPK的表达。所述的促进抗氧化应激表达还包括 促进肠道LC3-II和Beclin1的表达。所述的促进长寿相关信号通路的表达包括促进肠道 Nrf2及HO-1信号通路的表达。所述的促进长寿相关信号通路的表达还包括促进SIRT1 及PGC-1α的表达。

淫羊藿总黄酮购自于中国成都仁诚生物科技有限公司，样品凭证存放于三峡大学医学 院中草药研究所。采用HPLC-ELSD分析方法，淫羊藿总黄酮的含量达到89.58％(Yuanet al.,2014)。

成年雄性SD大鼠购自于三峡大学动物中心。大鼠饲养于温度及湿度受控的空间， 12h、12h明暗交替，自由进食。40只大鼠饲养至18月龄后随机划分成衰老对照组(12 只)、淫羊藿组(36只)。淫羊藿组从18月龄开始每天给予口腔灌胃淫羊藿总黄酮，浓 度分别为10、20、60mg/kg，连续给药6个月。9月龄大鼠作为成年对照组(12只)。

大鼠处死后，获得肠道标本。收集新鲜小肠样本并于液氮中冷冻后，-80℃存放。小段 肠组织(大约1cm)采用福尔马林固定。

免疫组织化学检测石蜡包埋后，组织切片，与特定的一抗标记。所有一抗购自于Santa Cruz(CA,USA)，SIRT1(Millipore,Bedford,MA,USA)，FoxO3a(Abcam,Cambridge, UK)，Nrf2(Abcam,Cambridge,UK)除外。免疫组化半定量的结果基于每组三只大鼠切 片的均值。每只大鼠分析三张片子。使用光学显微镜((Olympus,Shanghai,China)采集图 片。

Westernblot各组织总蛋白(40ug)采用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离后转移 至PVDF膜。将膜用特定的一抗孵育。洗去一抗后，与HRP结合的IgG孵育。采用化学 发光试剂盒检测膜上的蛋白。采用ImageJ进行分析蛋白相对量。