[发明专利]一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶领域，特别是一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法。

背景技术

与传统的化学催化相比，酶催化具有温和的转化条件、高的反应速率、优异的选择性等 优点，催化过程具有能耗低、物耗少、环境友好等优点。在大力倡导流程工业绿色化、节能 减排的新形势下，酶催化将在大宗化学品、精细化学品的工艺取代以及环境化学等方面发挥 日益重要的作用。但由于以下方面的约束，限制了酶催化更广泛的应用：(1)脱离了细胞内 的微环境，酶在细胞外对温度和pH耐受范围窄、适应性差、易失活等；(2)酶提取纯化的 费用较高，而在应用过程中重复利用率低、操作稳定性差、造成酶催化成本较高；(3)对非 天然底物的催化活性低。因此，如何最大限度地提高酶在胞外环境中的活性和稳定性、使其 更有效的适应非生理催化环境、实现高效催化是新一代工业生物催化技术发展的重要课题。 其中采用新颖的固定化酶技术、改造和发展高效固定化酶催化剂是解决以上问题的重要途径。

球化酶(Spherezyme)技术是一种无载体固定化酶技术。首先将含有酶的水相分散在含 有活性剂的油相当中进行，形成了油包水的乳液，这个过程称为乳化；然后加入交联剂，使 得蛋白分子之间通过交联剂连接稳定成球，经过交联的过程得到球化酶，如图1所示。由于 这种技术是在交联酶聚集体技术的基础上发展而来，在具备交联酶聚集体技术的所有优势的 同时，也在一定程度上克服了其粒径不可控，机械强度差等缺点，具有较高的比酶活。球化 酶在水油两相中形成，可以在一定程度上影响酶的方向，有利于酶在两相界面上定位。球化 酶技术形成的是粒径可控的球状结构，有利于固定化酶在反应体系中的分散，且球状结构拥 有较大的比表面积更利于固定化酶与底物接触反应。同时，球化酶的制备过程简单，成本低 廉。Brady等采用的球化酶技术，是将乳化法与交联酶聚集体技术结合制备出0.5-10μm的脂 肪酶微球，此微球可进一步团聚形成100μm左右的团聚体，在一定程度上实现了无载体固定 化酶的可控制备，但由于该方法采用的是传统的乳化技术，乳液液滴和固定化酶微球可控制 备性差。因此本发明采用新的乳化方法---膜乳化技术，以此为基础，利用球化酶技术对腈水 合酶进行固定化。

腈水合酶(Nitrilehydratase，EC4.2.1.84)是一种可以将腈类物质转化为酰胺类物质的酶， 例如：在全细胞或者游离的腈水合酶的催化作用下，丙烯腈可以转化为丙烯酰胺；3-腈基吡 啶可以转化为烟酰胺。酰胺类物质在有机合成、医药、农药等方面有着十分重要的应用。同 全细胞相比，游离的腈水合酶更受青睐，因为它具有严格的化学、区域和对映选择性及底物 专一性。但是，游离酶的使用通常会因为价格昂贵，温度、pH和操作稳定性低，难以回收利 用等因素受到限制。将游离酶进行固定化可以在一定程度上提高酶的耐受性，并且能够循环 使用，方便下游过程的操作。目前报道的腈水合酶固定化技术主要包括交联酶聚集体技术、 溶胶-凝胶包埋技术等。同交联酶聚集体技术相比，球化酶可控性更强，分散性更好；同有载 体固定化酶方法相比，球化酶技术成本低廉。

发明内容

本发明的目的是针对当前技术的不足，提供一种操作简单、成本低廉的固定化腈水合酶 的方法。该方法以膜乳化为基础，采用球化酶技术对腈水合酶进行固定化。膜乳化是在一定 的压力下，将分散相通过微孔膜分散到连续相中，由膜孔径来控制而呈单分散性，和传统乳 化方法相比，具有能耗低、制备条件温和、粒径大小及分布可控、制备的乳液稳定性和重复 性好等优点。另外，膜乳化的设备工艺简单易行，易于规模化，因而近年来被广泛关注。对 于球化酶而言，粒径均一、粒度可控是保证其得到很好应用的前提。该方法固定化酶制备工 艺简单，酶活损失小，且固定化效率较高。

本发明的技术方案是：

一种球化酶技术固定化腈水合酶的方法，包括以下步骤：

(1)向腈水合酶溶液中加入保护剂PLL，混合均匀作为水相；另向正己烷中加入表面 活性剂span-80，混合均匀作为油相；再把水相和油相混合搅拌制成粗乳液；

其中，腈水合酶溶液的浓度为0.1～0.5g/mL，PLL的质量为腈水合酶溶液质量的1％～3％； span-80的质量为正己烷质量的1％～5％；体积比为水相：油相＝1：3～9；