[发明专利]一种解脲芽孢杆菌及其生产高温过氧化氢酶的方法

说明书

一株解脲芽孢杆菌及及其生产高温过氧化氢酶的方法，属于生物工程领域。本发明提供了一株解脲芽孢杆菌，保藏编号为CCTCC NO：M 2015733。该菌以酵母粉为氮源，牛肉膏为碳源促进产酶，经液体发酵可得到高产量的过氧化氢酶，酶活高达41426 U/ml。本发明过氧化氢酶制剂制备简单、酶活性高，造价低廉，且温度稳定性好，在纺织、造纸等领域有良好的应用前景。

技术领域

本发明提供一株解脲芽孢杆菌及其生产高温过氧化氢酶的方法。属于生物工程领域。

背景技术

过氧化氢是一种强氧化剂，广泛应用与工业、食品和医疗领域的漂白和消毒，但是其残留物对生产工艺和身体健康有很大影响。过氧化氢酶可以特异性的将过氧化氢分解为无毒的水和氧气，是一种高效环保的过氧化氢去除方法。过氧化氢酶广泛存在于动植物和好氧微生物中，最初过氧化氢酶是从猪、牛等动物肝脏中提取纯化的，但该方法受限于原料、成本和季节等因素，且工艺复杂，易污染，酶的稳定性也较差。相比而言微生物发酵生产过氧化氢酶则有产量大、活性高、酶学性质丰富、成本低廉等诸多优点。因工业上过氧化氢酶的作用环境多为高温，碱性等恶劣条件，因此筛选耐高温过氧化氢酶菌株对纺织印染等工业具有重要意义目前国外已有相关微生物发酵过氧化氢酶商品，国内有一些文献及专利报道过氧化氢酶产酶菌株，但对耐热过氧化氢酶的研究及报道较少，其中多数菌株产酶能力在每毫升发酵液几百至几千个酶活力单位，仅江南大学陈坚教授和浙江大学谢雪凤文献中报道菌株酶产量达到3000 U/mL和2500 U/mL左右。本发明人发现一株产高温过氧化氢酶的菌株，通过液体发酵得到高酶活的过氧化氢酶酶液，该酶液可以高效分解过氧化氢。基于以上发现提出了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一株新型高温过氧化氢酶高产菌株，和以酵母粉为氮源，牛肉膏为碳源发酵生产过氧化氢酶的工艺。所产过氧化氢酶制剂活性高，生产成本低廉，热稳定性好，适于纺织、造纸等生产工艺中残留过氧化氢的去除。

本发明的技术方案：

所述解脲芽孢杆菌（Ureibacillus thermosphaericus）KAT-2，该菌种已于2015年12月9日保存于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2015733。

1、菌株的筛选及鉴定

(1)筛选：挑取从堆肥中分离纯化的细菌纯培养于前述液体种子培养基中震荡培养，取100微升发酵液加入100微升过氧化氢，有大量气泡产生的菌株为产酶菌株。

(2)鉴定：对该菌株16S rRNA进行PCR扩增与测序，NCBI数据库比对显示该菌为解脲芽孢杆菌。

(3)菌株特征：菌落呈扁平的圆形，周围乳白色，中间透明，边缘光滑，易于挑起。光镜下菌体为杆状。

(4)过氧化氢酶活性测性方法：发酵液超声破碎直至澄清，用pH 7.0的PBS缓冲液稀释适当倍数后备用。过氧化氢酶酶活测定方法为：2.9 ml反应液（pH 7.0、0.2 M PBS,20mM H₂O₂) 迅速加入0.1 ml酶液中, 在240 nm波长下测定吸光度的变化，每隔5s计数一次。H₂O₂的摩尔消光系数为43.6。过氧化氢酶酶活的定义为酶分钟消耗1微摩尔H₂O₂ 所用的酶量为1 U。

2、应用菌株KAT-2发酵生产过氧化氢酶。工艺如下：

(1)种子液制备：

种子培养基为：大豆蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl 1 g/L，pH为7.0.

种子液制备方法：从固体琼脂平板挑取一环单菌落置于50 ml种子液培养基中，55℃ 培养12 h，转速为180 r/min。