[发明专利]一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途

说明书

本发明公开了一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT‑RPA检测试剂盒及其用途。所述试剂盒包括有一对引物和一条探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.3所示。实验证明本发明的试剂盒能够特异性的检测小反刍兽疫病毒，并且在同等条件下对绵羊痘病毒、山羊痘病毒、羊口疮病毒以及口蹄疫病毒等其他重要的羊感染病毒没有扩增，说明该方法具有很好的特异性。灵敏度实验表明本发明所设计的用于检测小反刍兽疫病毒的RT‑RPA引物和探针能够在40℃下，扩增20min的条件下最少可检出150个拷贝的模板，且与RT‑qPCR具有很高的符合度。因此，本发明的试剂盒能够快捷、高效、灵敏的检测小反刍兽疫病毒，为小反刍兽疫病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段。

技术领域

本发明涉及一种检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种快速检测小反刍兽疫病毒的RT-RPA检测试剂盒及其用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。但是该技术需要特殊昂贵的热循环仪器以及熟练的操作人员，费时费力，难以用在现场诊断以及实验条件差的地方。重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)自从2006年被英国TwistDx Inc公司开发出来以来，就被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。以此为基础的核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。标准试剂盒的运行温度在37℃-42℃之间。进行实时监控的体系(如exo试剂盒)，需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

自开发以来，该技术已经被广泛的应用到人类疾病、兽医药物、食品工业以及农业上，比如用于检测土拉弗朗西斯菌、细螺旋体、HIV-1DNA、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、天花病毒、B型链球菌、大肠杆菌产生的志贺毒素、中东呼吸综合征冠状病毒、裂谷热病毒、口蹄疫病毒、牛冠状病毒、埃博拉病毒、苏丹病毒、马尔堡病毒、施马伦贝格病毒、牛病毒性腹泻病毒、黄热病毒以及戈登病毒等病原。与常规方法相比较，等温扩增实验具有很高的敏感性和特异性，这促使不同的公司商业化不同的等温扩增技术，比如，环介导的扩增(LAMP；Eiken,日本)，RPA(RPA；Alere,USA and TwistDx,UK)，链置换扩增(strand displacementamplification,Becton Dickson,USA)。LAMP技术已经比较成熟，并且得到广泛使用，到目前为止，已经超过1000份关于LAMP在不同疾病诊断中应用的科研文章。与RPA相比较，LAMP技术具有试验设计比较麻烦(3对引物)，特异性相对较弱(能扩增很多条带)，时间仍然相对较长，以及易于污染等不足的地方。

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病，发病率和死亡率均非常高。OIE曾将该病列为法定必报的A类动物传染病，一旦发现必须采取紧急严厉的措施控制和扑灭。自从1940年首次确认该病的存在以来，该病随后在大多数非洲国家、中东地区以及印度、巴基斯坦以及中国等国均有报道，对我国养羊业构成了严重威胁。PPRV基因组全长为15,948个核苷酸，含有6个转录单位编码6个连续的非重叠的蛋白，这些蛋白以5`-L-HN-F-M–P/C/V-N-3`的顺序编排。基于N蛋白的不同，PPRV可以被分为四大类，这种分类方式能很好的反映PPRV存在的地域差异。N蛋白虽然不具有免疫保护作用，但是该蛋白是PPRV编码的所有蛋白中丰度最高以及最具有免疫原性的蛋白，这是N蛋白被广泛的应用到诊断方法的开发中的原因。