[发明专利]一种膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法

权利要求书

1.一种膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征在于包括以下步 骤：

(1)大孔吸附树脂预处理；

(2)大孔吸附树脂静态吸附去杂蛋白，筛选出目的大孔吸附树脂；

(3)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻蓝蛋 白；

(4)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白；

(5)膨胀床偶联ADS-7固定床吸附纯化藻蓝蛋白，制得纯化的藻蓝蛋白。

2.根据权利要求1所述的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征 在于：在步骤(1)中，先用去离子水洗涤至水中无浑浊后，用95％乙醇浸泡24h，再用去离子 水洗至无乙醇味，除去树脂大孔内残留的溶剂及其它杂质，然后用4％盐酸浸泡2h，用去离 子水洗至中性，再用4％氢氧化钠浸泡2h，用去离子水洗至中性，抽滤，室温晾干至树脂不相 互粘连待用。

3.根据权利要求1所述的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征 在于：在步骤(2)中，称取大孔吸附树脂0.15g置于50mL具塞三角瓶中，加入30mL藻蓝蛋白粗 提液，密封，在200rpm/min，25℃下恒温振荡吸附3h；

吸附后，取上清液，分别测定280nm、620nm和650nm处的吸光度值，计算吸附后藻蓝蛋白 的纯度和含量，吸附前后总固形物含量和总蛋白含量，计算大孔吸附树脂对总蛋白、藻蓝蛋 白、杂质蛋白及固形物杂质的吸附容量，筛选出目的大孔吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征 在于：在步骤(3)中，以螺旋藻干粉与磷酸钠盐缓冲液的固液比为1:150g/mL，在-20℃和37 ℃反复冻融5次，每次冻融时间为4h；将冻融5次后的破壁液于5000rpm下离心30min，收集上 清液得到藻蓝蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中储藏备用。

5.根据权利要求1所述的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征 在于：在步骤(4)中，将吸附剂StreamlineDEAE装入膨胀柱中，打开出水口，使吸附剂 StreamlineDEAE均匀沉降，达到沉降床层高度为H0＝10.0cm时，停止加入吸附剂并关闭出 水口，最后使柱中吸附剂表面上留有1cm高度的溶液；

用蠕动泵将平衡缓冲液从膨胀床底部入口泵入柱中，吸附剂StreamlineDEAE在柱中不 断向上移动，当上升至膨胀床层高度为H＝20.0cm不再上升时，将顶部调节器固定在床层上 1-2cm处，继续平衡20-30min，使床层稳定；

待膨胀床稳定后，将进口流体从平衡缓冲液切换成藻蓝蛋白粗提液，开始进样，整个吸 附过程中，控制进样流速，保持膨胀床层的膨胀率稳定；用自动部分收集器每2min收集一次 流出液；停止进样后，进口流体从藻蓝蛋白粗提液切换成平衡缓冲液，进行向上冲洗，去除 膨胀床中的杂质和弱结合蛋白。

6.根据权利要求1所述的膨胀床与吸附树脂固定床偶联提取藻蓝蛋白的方法,其特征 在于：在步骤(5)中，在采用StreamlineDEAE膨胀床方式分离纯化藻蓝蛋白粗提液之后，收 集洗脱下来的浓缩藻蓝蛋白溶液，再经过ADS-7固定床分离层析，除去溶液中的杂质蛋白， 进一步提高藻蓝蛋白的纯度；采用湿法装柱，将2.0gADS-7装入层析柱中，打开出水口，让 水流出，当液面高于树脂层表面的1-2cm时，关闭出水口；

用25mM磷酸钠盐缓冲溶液平衡柱子；

连接好恒流泵和自动部分收集器，在柱顶加入10.0mL藻蓝蛋白溶液，所述藻蓝蛋白的 含量为2.1527mg/mL，总蛋白的含量为7.1880mg/mL，藻蓝蛋白的纯度为1.00；

分别用去离子水、0.5MNaCl和1MNaCl溶液洗脱，洗脱流速为2.0BV/h，流出液收集频 率为每15min收集一次；

分别以4.0BV/h、6.0BV/h、9.0BV/h和12.0BV/h的进样流速将膨胀床纯化后的藻蓝蛋白 溶液直接经过ADS-7固定床床层，自动部分收集器每一个床层体积收集一次流出液，流出液 即为纯化的藻蓝蛋白。