[发明专利]一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用

权利要求书

1.一种基于银沉积的甲胎蛋白(AFP)电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于包括以下步骤：

(1)用Al₂O₃抛光粉打磨直径为4mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3min，氮气吹干；以10mL含有浓度为1.0mmoL/L的HAuCl₄溶液为底液，以GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极在-0.8～0.6V电位范围内进行循环伏安扫描30圈后，将电极在0.1moL/L的KCl溶液中浸泡过夜，用PBS(pH7.4)缓冲液冲洗得到金纳米簇修饰玻碳电极(nano-Au/GCE)；

(2)取10μL1.0~2.5μg/mL的AFP第一抗体(Ab₁)标准溶液滴涂到nano-Au/GCE表面，在4℃冰箱中孵育12h，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗除去物理吸附得到Ab₁/nano-Au/GCE；

(3)取10μL质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到Ab₁/nano-Au/GCE表面，在37℃下孵育1h，以封闭非特异性结合位点，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(4)将10μL1.0pg/mL~10ng/mL的一系列不同浓度的AFP标准溶液滴涂到BSA/Ab₁/nano-Au/GCE表面用于与抗体特异性识别，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面得到AFP/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE；

(5)滴加6~10μLAuNPsPAMAM-C₆₀标记AFP第二抗体(Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀)到上述电极表面，在37℃下孵育60min，用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，再取10μL4~10mmoL的银增强剂滴涂到电极表面室温下避光孵育5min后用PBS(pH7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器(Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀/AFP/BSA/Ab₁/nano-Au/GCE)。

2.根据权利要求1所述的一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于所述步骤(5)中Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀的具体制作步骤为：

(1)AuNPsPAMAM-C₆₀的制备

在磁力搅拌下，将1.0mg的树枝状高分子聚酰胺(PAMAM)加入到1mL超纯水中，然后加入4mL乙醇继续搅拌使得溶液充分混匀，将1mL1.0mg/mL的C₆₀的甲苯溶液加入到上述混合溶液中，在室温下持续搅拌36h，用超纯水离心洗涤3次得到PAMAM-C₆₀；将PAMAM-C₆₀重新分散到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中；取97mL的超纯水于锥形瓶，在搅拌下加入1mL0.01mol/L的HAuCl₄和1mL的0.03mol/L柠檬酸二钠，之后逐滴滴加1mL0.047mol/L的硼氢化钠至溶液变为亮酒红色，再搅拌15min得金纳米溶液；取2mL上述金纳米溶液于2mLPAMAM-C₆₀分散液中室温下搅拌过夜，所得溶液在8000r/s离心，弃去上清液，重新溶解到2mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到AuNPsPAMAM-C₆₀溶液；

(2)Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀的制备

取0.2mL10μg/mL的Ab₂在搅拌的条件下加入到2mLAb₂-AuNPsPAMAM-C₆₀溶液中，室温下搅拌30min后在4℃下孵育过夜，得到的混合溶液在9000r/s离心15min，弃去上清液，重新溶解到1mLPBS(pH7.4)缓冲溶液中，得到Ab₂-AuNPsPAMAM-C₆₀溶液。

3.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于银沉积的甲胎蛋白电化学免疫传感器的制备及应用，其特征在于，用于AFP的检测，检测步骤如下：

(1)实验在电化学工作站上进行，采用三电极体系以所制备的免疫传感器为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，在PBS(pH7.4)缓冲溶液中进行测试；

(2)用线性扫描伏安法对一系列不同浓度AFP标准溶液及未特异性结合AFP的电极进行检测，扫描的电位区间为-0.1V~0.5V，扫描速度为50mV/s，记录示差脉冲伏安图，根据所得的峰电流值和AFP浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；

(3)将待测样品溶液代替AFP标准溶液进行检测。