[发明专利]一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方 法。

背景技术

心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病，尤其是心肌梗死已经成为人类死亡的主要病因 之一。许多心肌再生策略都是为了解决移植器官短缺的问题。在心肌替代治疗中，成体细胞 诱导产生的心肌细胞是治疗心肌缺血性疾病细胞替代治疗不失为一个很好的选择。如何安 全、高效获得诱导心肌细胞是用个性化细胞疗法治疗心肌梗死和心力衰竭亟待解决的问题。 成纤维细胞直接重编程为心肌细胞将为心肌细胞移植提供了新的细胞来源。基于之前的研 究，说明体细胞存在的微环境对体细胞表观遗传修饰和重编程具有极其重要的作用。

现有技术中还没有一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编 程为心肌细胞的方法，利用重编程因子(Gata4、Mef2c和Tbx5)将小鼠成纤维细胞直接重 编程为高效分化的心肌细胞为切入点，研究低氧对直接重编程产生心肌细胞的效率及成纤维 细胞重编程为心肌细胞过程中HIF-1表达水平的变化，系统阐述低氧对细胞直接重编程的作 用。同时检测了多潜能转录因子和表观遗传调控因子这在低氧刺激下的表达情况。用体细胞 直接重编程得到的个体化心肌细胞用于心肌梗死的修复，将为提高临床细胞移植的效率和安 全性打下基础。探讨低氧微环境与重编程的关系，为低氧下重编程机制的研究提供新的思路。 其技术方案如下：

一种低氧促进小鼠成纤维细胞重编程为心肌细胞的方法，包括以下步骤：构建慢病毒载 体，利用293T细胞包装生产病毒，将携带转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢病毒感染小 鼠背部皮肤成纤维细胞，将成纤维细胞直接重编程为心肌细胞；重编程过程中转染的细胞分 别进行对照组常氧培养和低氧2％O₂+5％CO₂+93％N₂预处理6h、12h，在培养过程中每天观 察重编程细胞的形态改变；在转导后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫细胞化学和流 式细胞技术检测低氧不同时间心肌特异标记Myh6阳性的细胞比率；收集低氧组重编程细胞， 利用RT-PCR检测HIF-1在重编程细胞中的表达，在mRNA水平上对其进行分析；

体外低氧条件2％O₂+5％CO₂+93％N₂下，培养小鼠背部皮肤成纤维细胞，实验组分低氧 6h、12h、24h、48h组，常氧为对照组；用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测小鼠皮肤成纤 维细胞中HIF-1、Oct4和Uhrf1的表达，在蛋白和mRNA水平对其进行分析。

优选地，加入低氧条件后，RT-PCR检测直接重编程第1、2、3、4周Myh6mRNA的表 达，第4周Myh6表达水平升高明显，低氧6h组高于0h和12h；免疫细胞化学方法检测低 氧条件下成纤维细胞直接重编程为心肌细胞内Myh6阳性率高于常氧组；低氧6h组Myh6 的表达倍数是对照组的4.59倍；流式细胞技术检测到直接重编程后低氧6h组Myh6的表达 量是对照组的4.71倍P<0.05；低氧12h组与常氧组阳性细胞比率差异不大；RT-PCR结果显 示HIF-1在细胞重编程的早期表达水平升高，低氧6h组高于低氧12h组，与Myh6的表达 变化相同，证明HIF-1在细胞直接重编程过程中被激活，起到促进细胞重编程的作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明成功将成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。低氧微环境明显提高了成纤维细胞 直接重编程为心肌细胞的效率。HIF-1在低氧条件下被激活，参与促进成纤维细胞直接重编 程的过程。多潜能转录因子Oct4和表观遗传调控因子Uhrf1在低氧微环境下在小鼠成纤维 细胞中表达水平升高，提示低氧微环境刺激有可能启动了细胞表观遗传学的改变和细胞的多 潜能性，从而影响细胞的功能、增殖和分化。HIF-1通路在其中发挥了重要作用。

附图说明

图1是原代细胞培养，图1(A)图为原代小鼠皮肤成纤维细胞(×40)，图1(B)图 为小鼠原代心肌细胞(×100)；