[发明专利]用于检测高危型HPV的方法、寡核苷酸和试剂盒

说明书

本发明提供一种检测常见的高危型HPV的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，对样品中可能存在的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82进行初步检测和型别鉴定。本发明可以同时检测18种高危型别，并同时对HPV16、18进行基因分型。本发明基于18种高危型HPV及其他型别在进化树上的亲缘性，设计高危型HPV引物和探针，在保证检测准确性、灵敏度和特异性的同时，显著降低背景荧光值，并显著增加检测通量和极大地降低检测成本。

技术领域

本发明属于生物科学和生物技术领域，特别涉及一种检测18种常见的高危型HPV的方法、寡核苷酸和试剂盒，采用荧光PCR技术，对临床样品中可能存在的HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、73和82进行初步检测和型别鉴定。

背景技术

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一类可感染人表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒，能够引发尖锐湿疣和宫颈癌等疾病。人类是HPV的唯一宿主。HPV基因组为双链环状DNA，长约7900对碱基(bp)，含8个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，由3个基因区组成，包括早期区(E区)、晚期区(L区)以及非编码区或上游调控区。E区按顺序可分为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与HPV的细胞转化功能和致癌性相关。L区主要有L1和L2两个基因。

目前科学家们已发现120种以上的HPV亚型。不同的HPV亚型感染导致不同病变，根据其是否可以引起癌症，HPV亚型可分为：高危型HPV，与宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN I/II/III)的发生相关，常见的有HPV16、18、31、33、35、45、51、52、56、58、29、68等亚型；低危型HPV，一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌，常见的有如HPV6、11、42、43、44等亚型。关于高危型HPV与低危型HPV的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68共13种亚型列为高危HPV，并将HPV26、53、66、73和82共5种亚型列为中等风险HPV。在实际检测时，常常将中等风险HPV亚型也归于高危型HPV。

80％的女性一生中都会感染HPV病毒，通常病毒在6～8个月内会自然清除，仅25％会发生癌前病变。高危型HPV的反复或持续感染被视为几乎所有宫颈癌发生的必要条件。现有研究结果显示，宫颈病变程度越重，高危型HPV感染率越高；在CINI、CINII和CINIII患者中，高危型HPV感染率分别为30％、55％和65％，而99.8％以上的宫颈癌患者体内能检测到高危型HPV感染，HPV阴性者几乎不会发生宫颈癌。在这些高危型HPV中，最为常见的是HPV16，其次为HPV18，这两种高危型HPV亚型的感染率最高，可达70％；若再加上HPV45和HPV31，这4种高危型HPV的感染率可达80％左右。我国一项横跨7个宫颈癌发病率不同地区的19家医院、共纳入1244个病例的中国宫颈癌相关高危型HPV亚型分布(以医院为基础的)多中心研究证实，中国不同区域的宫颈癌及宫颈高度病变都是以感染HPV16/18为主，大约85％的宫颈癌确诊病例属于这两种亚型，且HPV16/18的感染率和致癌率都明显高于其他高危型HPV(Chen W et al.Human papillomavirus type-distribution in cervicalcancer in China:the importance of HPV 16and 18.Cancer Causes and Control,2009,20:1705-1713)。