[发明专利]一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法

权利要求书

1.一种诱导转基因花生发状根生物反应器产白藜芦醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）克隆烟草根特异启动子NtR12和花生白藜芦醇合酶基因AhRESS；

（2）烟草根特异启动子NtR12驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR12-AhRESS的构建；

（3）pBI121-NtR12-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生；

（4）转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养；

（5）醋酸钠诱导花生发状根使其白藜芦醇含量增加；

（6）花生发状根白藜芦醇的提取及检测；

（7）液体培养基中白藜芦醇的提取及检测；

其中，步骤（1）中烟草根特异启动子NtR12的序列为SEQ ID No：1，花生白藜芦醇合酶基因AhRESS的序列为SEQ ID No：2；

步骤（2）具体方法为：

1）将烟草根特异启动子NtR12连接至pMD18-T 载体中，得到pMD18-NtR12载体；

2）pBI121-NtR12-GUSA载体构建：将pBI121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，从pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA；将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR12载体进行酶切反应，将NtR12启动子连接至pBI121-GUSA载体中，得到pBI121-NtR12-GUSA载体；

3）pBI121-NtR12-AhRESS载体的构建：将花生白藜芦醇合酶基因AhRESS基因连接到pBI121-NtR12-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-AhRESS载体；

步骤（3）中发根农杆菌介导的花生遗传转化外植体分别为叶片、子叶、上胚轴和下胚轴外植体；

步骤（4）中转pBI121-NtR12-AhRESS花生发状根液体悬浮培养所用培养基为1/2MS培养基，培养体系为：100 mL 1/2MS液体培养基，接种2-3根；培养条件为28℃，以120rpm的震荡摇床中黑暗培养14d；

步骤（5）中醋酸钠诱导的时间为花生发状根培养至第11天时，醋酸钠的浓度为20mM，诱导时间为24h；

步骤（6）中花生发状根白藜芦醇的提取采用浸提法，检测用HPLC方法进行，其中色谱条件为：色谱柱 ODS，流动相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱温25℃，进样量10 μL；

步骤（7）中液体培养基中白藜芦醇的提取采用以乙酸乙酯为萃取剂的萃取法获得，检测用HPLC方法进行，其中色谱条件为：色谱柱 ODS，流动相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱温25℃，进样量10 μL。