[发明专利]特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法

权利要求书

1.特异启动子NtR2驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR2-AhRESS经发根农杆菌介导转化花生；

（2）转pBI121-NtR2-AhRESS花生发状根液体悬浮培养；

（3）转pBI121-NtR2-AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测；

步骤（1）的具体方法为：

1）将烟草根特异启动子NtR2连接至pMD18-T 载体中，得到pMD18-NtR2载体；

2）pBI121-NtR2-GUSA载体构建：利用限制性内切酶BamHⅠ及SacⅠ对pBI121质粒载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从pCAMBIA1301载体中克隆GUSA基因，连接至酶切后的pBI121载体上，得到pBI121-GUSA载体；将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接至pBI121-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-GUSA载体；

3）pBI121-NtR2-AhRESS载体的构建：将花生白藜芦醇合酶基因AhRESS基因，连接到pBI121-NtR2-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-AhRESS载体；

所述步骤（1）中烟草根特异启动子NtR2的序列为SEQ ID No：1，花生白藜芦醇合酶基因AhRESS的序列为SEQ ID No：2；

所述步骤（1）中发根农杆菌介导的花生的遗传转化外植体分别为叶片、子叶、上胚轴和下胚轴外植体；

所述步骤（2）中转pBI121-NtR2-AhRESS花生发状根液体悬浮培养所用培养基为MS培养基+500 mg/L Cef，第一次继代培养基为MS培养基+300 mg/L Cef，第二次继代培养基为MS培养基+100 mg/L Cef，第三次继代培养基为MS培养基；三次继代后Cef浓度降至0；

所述步骤（3）中转pBI121-NtR2-AhRESS花生发状根白藜芦醇含量的检测方法为HPLC，色谱条件为：色谱柱 ODS，流动相乙腈：水=25:75，流速1.0 mL/min，检测波长306 nm，柱温25℃，进样量10 μL。