[发明专利]特异启动子NtR12驱动AhRESS提高花生发状根系产白藜芦醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及特异启动子NtR12驱动AhRESS在花生发状根系产白藜芦醇的方法，属 于植物基因工程领域。

技术背景

白藜芦醇（Resveratrol，简称Res），是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、 花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的 抗氧化剂，可以降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗辐射，抗衰老，防治心血管疾病 等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少，利用植物 基因工程技术高效生产白藜芦醇是大量获得白藜芦醇的重要途径。

白藜芦醇广泛存在于种子植物中，作为芪类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢 途径合成的。刘蕾等克隆了白藜芦醇合酶cDNA，并将其转化花生的下胚轴、胡萝卜的下胚轴； 同时，也把花生RESS转化酵母。许玉芬等成功构建了花生白藜芦醇合酶基因的酵母表达载 体，并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母的染色体上；成功构建了由Ubi启动子驱动的花生 白藜芦醇合酶基因单子叶植物表达载体，分别利用农杆菌介导和基因枪转化法转导甘蔗。 黄国强等研究了白藜芦醇合酶基因在花生根中的特异表达，研究结果表明：该基因的转录 表达在根的韧皮部，其他组织中未见表达；酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增 强。林荣华等以花生中的白藜芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表 达载体pB6RS，利用电穿孔法将pB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导 将pB6RS转化烟草（云烟85），得到了阳性植株。

由于白藜芦醇的重要生理功能，近几年，人们开始研究利用生物技术提高植物材 料中白藜芦醇的含量。Giovinazzo等研究者以35S启动子调控白藜芦醇合酶基因进行番茄 遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷胱甘肽还原酶的总体水平，结果表明：转基 因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。Hüsken等利用油菜种子特 异表达启动子驱动白藜芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白藜芦醇合酶底物的 另一条支路，检测T₀代油菜种籽中的Res含量，发现以鲜重计其最高含量为361μg/g，同时 还获得了品质改善且保健性提高的油菜种籽。但目前，通过根特异启动子驱动白藜芦醇合 酶基因表达生产白藜芦醇的研究未见报道。

发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够侵 染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，诱导植物产生发状根(毛状根)。发状 根相对于正常的根，有很多优点。理论上，发状根来源于一个植物细胞，不是嵌合体，所以其 遗传性状稳定，继代多次仍然具有原始发状根的遗传特性；发状根能够在无外源激素的培 养基中自主生长，且生长速度快，易操作和调控，不受季节和地域限制；某些次生代谢产物 在发状根中含量比正常根高。因此，利用发状根生产次生代谢产物是一条可靠和有效的途 径。

在花生各组织中，白藜芦醇以根中的含量最高。因此，快速获得大量根，既获得了 植源性的白藜芦醇材料，进而可以大量提取白藜芦醇。而发根农杆菌可以侵染植物，在伤口 处形成发状根，且发状根无激素依赖性，又可以快速生长，在短时间内增长数百倍甚至上千 倍。基于此，以发状根液体培养是快速大量生产白藜芦醇的一条捷径。刘杰等优化了发状根 的培养条件，并初步探索了诱导发状根产生白藜芦醇的条件，研究结果表明：花生发根的最 适基本液体培养基为无激素的MS培养基，添加植物激素会不同程度的抑制发状根的生长， 100μmol/L水杨酸（SA）可以提高花生发状根白藜芦醇苷合成分泌以及白藜芦醇的合成。 黄丽萍等探究了不同发根农杆菌转化不同品种烟草发根效率的差异，结果表明：不同烟草 品种和发根农杆菌菌株均显著影响毛状根的诱导率。Fabricio等研究发现，花生发状根可 以高效产生白藜芦醇，不同生长阶段的发状根诱导产生白藜芦醇含量不同，且在合适的生 长阶段，一定浓度的醋酸钠诱导发状根24h，白藜芦醇会被分泌到液体培养基中。但目前， 通过根特异启动子驱动白藜芦醇合酶基因在花生发状根表达生产白藜芦醇的研究未见报 道。