[发明专利]一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法在审
| 申请号： | 201610025953.2 | 申请日： | 2016-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN105441478A | 公开（公告）日： | 2016-03-30 |
| 发明（设计）人： | 庄伟建;马世伟;陈华;郑钦;蔡铁城;邓烨;张冲 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00 |
| 代理公司： | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡学俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 烟草 特异 启动子 ntr2 驱动 ahress 基因 藜芦 方法 | ||
1.一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）克隆烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因；
（2）烟草根特异启动子NtR2驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121-NtR2-AhRESS的构建；
（3）pBI121-NtR2-AhRESS经根癌土壤杆菌C58介导转化烟草，获得转基因烟草植株，并对其进行分子鉴定；
（4）对转基因植株进行分子检测，利用HPLC检测根中白藜芦醇的含量。
2.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）中烟草根特异启动子NtR2的序列为如SEQIDNo：1所示。
3.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤（1）中花生AhRESS基因的序列如SEQIDNo：2所示。
4.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤（2）中烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体的出发载体为pBI121质粒载体，所述的根特异启动子驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体的启动子是烟草根特异性启动子NtR2，所述的烟草根特异性启动子基因NtR2下游包含花生AhRESS基因。
5.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：步骤（2）具体方法包括以下步骤：
1）克隆烟草根特异启动子NtR2，并连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-NtR2载体；
2）pBI121-NtR2-GUSA载体构建：将pBI121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，从pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA；将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接至pBI121-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-GUSA载体；
3）pBI121-NtR2-AhRESS载体的构建：克隆花生AhRESS基因，并连接到pBI121-NtR2-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-AhRESS载体。
6.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤（3）中pBI121-NtR2-AhRESS载体的遗传转化采用根癌土壤杆菌C58介导的叶盘法；用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的DNA进行PCR分子检测；用改良的CTAB法分别提取转基因植株叶片和根RNA，用逆转录试剂盒逆转录后进行RT-PCR，进行目的基因表达模式分析。
7.根据权利要求1所述的一种烟草根特异启动子NtR2驱动AhRESS基因产白藜芦醇的方法，其特征在于：所述步骤（4）中转基因烟草根中白藜芦醇HPLC检测色谱条件为：色谱柱ODS，流动相乙腈：水=25:75，流速1.0mL/min，检测波长306nm，柱温25℃，进样量10μL。
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