[发明专利]马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒

说明书

本发明属于植物样品内失活线虫的分离技术领域，公开了一种马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒。该分离液由pH为4.40的盐酸溶液、纤维素酶和果胶酶组成，纤维素酶和果胶酶的浓度分别为0.005和0.001mg/μl。马尾松病死木中失活线虫的分离方法按照以下步骤：将马尾松病死木材料纵切成长0.8～1.0cm，厚0.1～1mm的切片置于离心管；移取2000μl分离液于装有切片的离心管，用镊子使切片全部浸入溶液；把离心管固定在恒温振荡器中，采用50℃和250R振荡6h。本发明的分离技术，扩大了可用于检测线虫的样本来源，提高了分离效率。本发明的分离技术简单高效，可制备成试剂盒进行大规模推广。

技术领域

本发明属于植物样品内失活线虫的分离技术领域，具体涉及一种马尾松病死木中失活线虫的分离液及其分离方法和试剂盒。

背景技术

松材线虫病是重要的检疫性病害，截至2012年底，我国先后有17个省(自治区、直辖市)的275个县级行政区发生过松材线虫病，占县级行政区域总数9.6％，给我国森林资源和生态环境造成了巨大破坏(宋玉双，2013)。截至2013年，全国仍有15个省(自治区、直辖市)的179个县(市、区)发生松材线虫病(国家林业局2013年第2号公告)。但是中国幅员辽阔，针叶树占森林面积的42.7％，而松树约占整个针叶林面积的58％，适宜松材线虫病流行的地区较广。根据研究，松材线虫病在平均温度10℃的地区就能发生，我国的海南、广东、广西、福建、台湾、浙江、江西、云南、贵州、四川、湖南、湖北、江苏、安徽、河南、陕西、山东、河北、山西、北京、上海、天津、香港均为松材线虫的适生区，而辽宁、新疆、西藏、甘肃的部分地区也适合松材线虫的发生(何龙喜等，2014)。

关于松木中线虫的分离技术，目前常用的方法有：贝尔曼漏斗法和浅盘法两种技术，具体步骤如下所述：

1.贝尔曼漏斗法：①置备一只直径10～15cm的玻璃漏斗，玻璃漏斗末端接上一段长约15cm的乳胶管，置于漏斗架上，在乳胶管上装一止水夹(弹簧夹)。②对松木样品细木条(或木片、木屑)进行线虫分离时，用剪刀将其剪碎或用尖头镊子、解剖针将其撕碎，剪取大小合适的2层纱布将碎体包裹后，放入漏斗中，关闭漏斗下端乳胶管上的止水夹。然后从漏斗壁慢慢注入清水，使清水充满漏斗和下面乳胶管，水要漫过纱布包。③在25℃下，浸泡24h后，将培养皿置于乳胶管下，打开止水夹，接取15ml浸泡液，供显微镜检验或计数。

2.浅盘法：①浅盘分离装置由2个口径不同的用不锈钢或铝合金等材料制成的浅盘组成，将其中口径略小、底部为粗网筛的浅盘放在另一个浅盘上面。②将大小合适的2层纱布平铺于筛盘上，松木样品细木条(或木片、木屑)置于筛盘纱布上面，慢慢注入清水，使清水浸泡全部样品。③在25℃下，浸泡24h后，移去筛盘，把大浅盘内的样品浸泡液倒入烧杯。烧杯内浸泡液中的线虫可通过自然沉降或离心方法，移去多余的水分，浓缩至适宜的量，以便显微镜检验或计数。

这两种分离线虫的原理是线虫是喜水动物，遇水便会从植物体游出。线虫个体小，可穿过纱布，同时由于线虫身体比重比水大，所以线虫便会下沉到浸泡样品的液体底部(冯志新，2000)。这也决定了这两种技术只能分离出活动性较强的线虫，无法分离出样本中失活线虫。

线虫的活动度受温度和本身生命力影响。生产上存在大量含有失活线虫的植物样品。比如冬天低温和夏天高温，线虫活动减慢；比如冰冻样本内，线虫已经死亡。如何分离出植物样本内失活线虫，国内未见报道。

鉴于松材线虫病是我国的头号森林病害，防治马尾松松材线虫病的最有效途径是抗病育种，而抗病育种需要检测数量巨大的样本内的松材线虫，因此需要将这些样本冰冻储藏起来，因此必须发明植物样本内失活线虫的分离技术。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种马尾松病死木中失活线虫的分离液。该液体对分离马尾松松木内线虫具有高特异性，可用于分离马尾松病死木中的线虫。