[发明专利]一种纳米非病毒基因输送体系及其应用

说明书

本发明涉及一种纳米非病毒基因输送体系及其应用。本发明首次针对骨关节相关细胞的特点，找到了合适的基因转染试剂。所述的转染试剂是低分子量聚乙烯亚胺与环糊精的复合物，将其用于将外源基因转染入骨关节相关细胞中，具有很高的转染效率，且毒性低。

本发明是申请号为CN 201010292778.6的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种纳米非病毒基因输送体系及其应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞在骨组织工程中具有十分重要的地位，是骨组织工程中种子细胞的主要来源。而滑膜细胞和软骨细胞则在骨关节炎的发生和进程中扮演着十分重要的角色，它们也常常被作为基因治疗的靶细胞。然而，这些骨关节相关细胞目前存在着基因转染效率低下的问题，这成为了技术进步的瓶颈，大大限制了临床基因治疗的开展。

基因治疗是指运用基因工程技术将外源基因导入患者细胞内，以纠正或补偿致病基因引起的疾病。将外源基因导入细胞内必须借助一定的技术方法。目前基因转染的方法主要可以分为三大类，一类是生物学方法，一类是物理方法，还有一类是化学方法。生物学方法主要是指运用病毒作为载体将外源基因导入细胞的技术。目前研究最多的病毒载体是逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体等。物理方法主要是指运用物理手段将外源基因导入细胞的技术。目前常用的方法有显微注射，电击穿膜，压力渗透，超声喷雾，粒子轰击等方法。化学方法则是指利用化学试剂将外源基因导入细胞的技术。目前较常用的转染试剂是以阳离子脂质体为母体材料的一系列衍生物。另外利用聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)和壳聚糖(Chitosan)为母体材料的一系列衍生物也有很多的报导。化学转染试剂种类繁多，考虑到转染效率、毒性等问题，不同的细胞所使用的化学转染试剂是不同的。因此，对于特定的细胞，需要找到最为合适的化学转染试剂。

上述三类方法，彼此各有优缺点，实验者往往会根据不同的需求而使用不同的方法将外源基因导入细胞。在使用不同的导入方法时，主要需要考虑到以下这些因素：安全性，有效性，可操作性以及成本因素。比如在生产转基因动物的时候，往往会通过显微注射的方法将外源基因导入受精卵细胞，或者精子和卵母细胞。但是这种方法需要实验操作人员有很强的操作经验和熟练的操作技术，另外显微注射方法对仪器的要求也比较高，这对于一般的细胞转染是不适合的。

基因载体是携带外源基因导入细胞内的载体系统，一般可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。这两类载体有各自的优缺点。病毒载体往往具有一定的免疫原性，细胞毒性，随机整合到宿主细胞基因组所引起的致癌作用，制备较为复杂等缺点，同时其具有较为广谱的宿主细胞，对于原代细胞有着较高的转染效率，这是非病毒载体所难以企及的。而非病毒载体有着较好的生物相容性和较低的细胞毒性，免疫原性也几乎没有。但它在不同靶细胞上的转染效率有着巨大的差异。这种差异主要体现为在原代细胞上相对较低的转染效率，这在一定程度上制约了其在临床上的运用。理想的基因载体应该是低毒、高效、低成本又可操作。

非病毒基因载体的低细胞毒性、低免疫原性和较好的生物相容性一直被认为有望取代病毒载体。但是较之病毒基因载体，较低的转染效率一直是困扰其应用的巨大障碍。需要通过化学修饰等方法来提高非病毒基因载体的转染效率。

非病毒基因载体根据母体材料的不同可分为两个大类，一类是阳离子脂质体及其衍生物，另一类是阳离子聚合物及其衍生物。阳离子脂质体主要有Lipo2000，Fugene6等，它们在体外对于一些细胞系往往具有稳定而且较高的转染效率，这也是它们其中一些能够成为商品化转染试剂的一大原因。但是，阳离子脂质体对于一些原代细胞较低的转染效率确实制约了其在某些领域的运用。另外，在体内运用阳离子脂质体进行基因治疗时，阳离子脂质体往往会被血液中的血清白蛋白凝聚并且沉淀下来，从而大大降低了其转染效率。

影响非病毒基因载体转染效率的因素有很多，可以从材料学角度和生物学角度分别进行讨论和分析。