[发明专利]通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生

说明书

本发明申请是基于申请日为2001年1月26日、申请号为200910133079.4、名称为 “通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生”的发明专 利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及培养微生物和回收微生物脂质的新方法。具体地，本发明涉及生产微 生物多不饱和脂。

背景技术

在真核微生物中生产多烯脂肪酸(含有2个或更多个不饱和碳碳键的脂肪酸)一般 认为需要分子氧的参与(即需氧条件)。这是因为据认为在所有非寄生性真核微生物的脂肪 酸中形成的顺式(cis)双键参与直接的氧依赖型去饱和反应(氧化微生物去饱和酶系统)。 其它已知需要分子氧的真核微生物脂质包括真菌甾醇和植物甾醇，羟基类胡萝卜素 (oxycarotenoids)(即叶黄素)，泛醌，和从任一种这类脂质制备的化合物(如次级代谢产 物)。

已证实某些真核微生物(如藻类；真菌，包括酵母；和原生生物)在发酵罐中可以很 好地生产多烯脂肪酸。但是，极高密度培养(微生物的生物量大于100g/L，特别是商业规模 的)会降低多烯脂肪酸的含量，这样会降低多烯脂肪酸的生产力(productivity)。这可能部 分是由于几种因素，包括由于微生物的高浓度造成对氧的高需求，而难于维持发酵液中的 溶氧水平。保持较高溶氧水平的方法包括提高通气速率和/或采用纯氧替代空气通气和/或 提高发酵罐的搅拌速度。这些解决方法一般提高脂质生产的成本和发酵设备的资金成本， 而且会产生其它的问题。例如，在高细胞密度时增加通气容易在发酵罐中产生严重的起泡 问题，加强搅拌会由于发酵液中剪切力增加而导致微生物细胞破碎(这会导致脂质释放到 发酵液中，从而被氧化和/或被酶降解)。对于正处于氮受限或耗尽以诱导产生脂质从而细 胞壁较弱的细胞，细胞破碎问题更为突出。

结果，当以极高细胞密度培养生产脂质的真核微生物时，它们的脂质通常都只含 有极少量的多烯脂肪酸。例如，以醇为碳源培养斯达氏油脂质酵母(Lipomycesstarkeyi) 在140小时到153g/L的密度，产生的脂质浓度为83g/L。但是在浓度大于100g/L时酵母的多 烯脂肪酸含量平均只有总脂肪酸的4.2％(在细胞密度为20-30g/L时其含量从占总脂肪酸 的11.5％开始减少)。Yamauchi等，J.Ferment.Technol.，1983，61，275-280。这样产生的多 烯脂肪酸浓度只有约3.5g/L，平均多烯脂肪酸生产力只有约0.025g/L/hr。此外，在酵母脂 质中唯一报导的多烯脂肪酸是C18:2。

已证实另一酵母，Rhodotorulaglutinus，具有的平均脂质生产力约为0.49g/L/ hr，但其脂质中多烯脂肪酸含量也较低(占全部脂肪酸的15.8％，14.7％C18:2和1.2％C18: 3)，导致在补料分批培养中多烯脂肪酸生产力只有约0.047g/L/hr，在连续培养中是 0.077g/L/hr。

本发明人之一以前已证实破囊壶菌目(Thraustochytriales)的某些海洋微藻类 在发酵罐中是极好的多烯脂肪酸生产者，特别是在低盐，特别是极低氯化物水平培养时。其 它有人描述了Thraustochytrids在培养120小时，细胞密度为59g/L时的平均多烯脂肪酸 (DHA，C22:6n-3；和DHA，C22:5n-6)生产力约为0.158g/L/hr。但是这样的生产力只能在约 50％的海水盐度下达到，这样的浓度会严重腐蚀传统的不锈钢发酵罐。

生产含多烯脂肪酸的微生物脂质，特别是高度不饱和脂肪酸，如C18:4n-3，C20: 4n-6，C20:5n3，C22:5n-3，C22:5n-6和C22:6n-3，的费用一直较高，部分原因是含高水平多 烯脂肪酸的真核微生物培养密度的限制和在这样的高细胞浓度下的氧限制以及获到高生 产力所需的较高温度的限制。

因此，需要高浓度培养微生物，并同时利于提高含多烯脂肪酸的脂质的产量。

发明内容

本发明提供了培养真核微生物的方法，所述微生物能产生至少约20％的生物量的 脂质，本发明还提供生产这样的脂质的方法。优选这些脂质包含一或多种多烯脂肪酸。此方 法包括向含有真核微生物的发酵培养基加入碳源，优选是非醇碳源，和限制性营养源。优选 地，所述碳源和营养源的添加速度足以提高发酵培养基的生物量密度到至少约100g/L。