[发明专利]用于检测人类CKIT基因7种突变的探针、引物及试剂盒

说明书

本发明公开了用于检测人类CKIT基因7种突变的探针、引物及试剂盒，其中CM1～CM7的7组引物和探针，每组中突变上游引物能与CKIT基因保守序列结合，突变下游ARMS引物能与其相应的突变序列特异性结合，扩增突变序列；检测探针能够与扩增片段结合，阻断探针能与突变位点对应的野生型序列特异性结合，抑制野生型非特异性扩增。本发明采用特异性突变引物和探针阻断技术，可准确检测CKIT基因7种突变类型；建立的实时荧光PCR扩增反应体系的试剂盒方便对CKIT基因突变的快速检测，操作简单，结果易读；检测方法灵敏度高，50拷贝突变能稳定检出；特异性好，20ng野生型基因组DNA无非特异性扩增，检测能力高达1％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测人类CKIT基因7种突变的探针、引物及试剂盒。

背景技术

胃肠间质瘤(gastrointestinal stroml tumor，GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，其发病率有逐年增高的趋势。主要发生于胃肠道、大网膜和肠系膜，占所有胃肠道肿瘤的0.2％，占胃肠道肉瘤的80％，C-kit(CD117)通常呈阳性表达。对绝大多数患者来说，基因突变是肿瘤形成的关键因素，其中CKIT基因突变占80～85％，PDGFRα突变占7％，野生型(未检测到突变)占10～15％。GIST患者手术切除后容易复发，中位复发时间约为2年，仅有10％的患者长期随访未见复发。

CKIT是一种原癌基因，它表达的干细胞生长因子受体和EGFR同是跨膜蛋白，不同的是它的胞外区有5个或3个免疫球蛋白的结构域，能与配体SCF(Stem cell factor)结合使KIT发生二聚化，二聚化后KIT胞内的激酶区自磷酸化从而激活下游信号传导最后促使细胞增殖；C-kit表达于生殖细胞、肠间质细胞、骨髓原造血细胞等。CKIT突变以后会使激酶区不再受scf的调控而持续激活，细胞不断增殖导致肿瘤发生。

甲磺酸伊马替尼(格列卫)是一种分子靶向药物，用于治疗不能切除、或发生转移的恶性胃肠道间质肿瘤，在GIST的治疗中取得了非常好的疗效。目前，对于术后复发或转移的GIST患者，如果存在高危因素或不能进行手术治疗，甲磺酸伊马替尼(格列卫)是标准的一线药物，当格列卫用药过程中不能耐受，或出现疾病广泛进展(generalizedprogression)时，二线药物应用苹果酸舒尼替尼(索坦)。

GIST已被证实对于传统化疗不敏感。同时因为多数GIST患者存在CKIT激活，因此抑制KIT和手术已成为GIST的主要治疗模式。2002年2月，FDA批准伊马替尼治疗CKIT阳性不可切除和/或转移性恶性GIST患者。S0033临床实验数据证明：伊马替尼每日400mg作为初始标准剂量，可安全有效的诱导应答。大量临床实验表明：是否携带CKIT或PDGFRA突变及其类型被证实是疾病对伊马替尼应答状态的预测因素，其中携带D816V突变的GIST患者对伊马替尼耐药。

目前检测基因突变的方法主要有测序法、溶解曲线法和液相芯片法。直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30％；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染，通常要1-2天才可出检测结果；特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。染料溶解曲线和探针溶解曲线法都无法有效区分同一位点的多种突变类型。液相芯片法操作过程复杂，且容易污染，假阳性率高。

发明内容

为了解决现有的CKIT基因突变检测方法检测效率低、样品易污染、检测时间长、准确性差、区分度困难等问题，本发明提供了用于检测人类CKIT基因7种突变的引物和探针。本发明还提供了含有该引物和探针的试剂盒，实现不限场地的快速准确检测。

本发明提供的用于检测人类CKIT基因7种突变的引物和探针，其核苷酸序列如下：

CM1：D816V突变

突变上游引物CW1-F：SEQ ID NO:1，