[发明专利]具有较大张力的小环形核苷酸探针及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了具有较大张力的小环形核苷酸探针的制备及其应用，通过“无铜点击反应”制备得到了具有较大环张力的小环形核苷酸；其制备方法是将标记有相互作用性标记系统的核苷酸短单链和小环形核苷酸杂交，得到检测信号处于“TURN OFF”的探针，当目标分子诱导核苷酸短单链置换，信号被“TURN ON”，从而实现对目标分子的检测；本发明所制备的具有较大张力的小环形核苷酸探针，不仅能实现细胞外分子的高选择性识别，而且能有效地用于细胞内生物分子的识别与调控，并且制备过程温和，实验操作步骤简单，应用范围广，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及具有较大张力的小环形核苷酸探针，还涉及该探针的制备方法和应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因，其在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA可以通过与靶基因的完全互补或不完全互补来达到靶向切割mRNA或者抑制靶基因的翻译，从而起调节基因表达的作用；然而这些靶向mRNA广泛参与一些重要的细胞过程，包括细胞的生长、增殖、分化和凋亡，并且在不同的发育阶段其表达水平也有所不同。因此miRNA被当作许多细胞活力的重调控者。miRNA表达的改变与许多疾病和失调都有或多或少的关系，但是由于miRNAs高度的序列相似性、种类的多样性以及序列的短小性，miRNA临床诊断面临了一些挑战。采用传统的方法将miRNA从组织活细胞中分离出来，然后进行检测，这个过程中由于miRNA在细胞内的浓度是非常低的，所以必须经过富集和扩增，这会大大耗费时间、精力以及资金；Northern Blot法被认为是miRNA检测和确认的金标准，但是其特异性和灵敏度均不高，虽然后来一些科学家也对该方法进行了拓展(比如采用锁核酸LNA修饰的杂交探针、核糖核酸酶保护法)，但总的来说这些方法相对来说需要的样品量较大、步骤繁琐、不适用于高通量分析等限制了其临床应用。采用RT-qPCR检测miRNA的灵敏度很高，样本量也相对少，但是由于miRNA序列短，要求引物的序列就更加短小，从而就要求更低的溶解温度，然而低的溶解温度会影响PCR扩增。导致所检测到的是前体的miRNA，而并非是成熟的miRNA，在细胞中前提的miRNA和成熟的miRNA的水平也不一致，所以该方法也常产生一些假阳性信号，且反应所需要酶和试剂以及检测的仪器都非常的昂贵，因此也使得成本相应较高。微阵列芯片技术(Microarray)发已被广泛用于miRNA的检测，相对于其他的检测方法其最大的优点是具有高通量性，然而该技术花费较大，需要机器加工，一些小型实验室也不具备这些条件；另外，其灵敏度也比较低。以纳米材料为基础的一些检测方法也越来越多的学者进行了研究，比如纳米金标记技术的检测、基于纳米孔的microRNA传感器、基于量子点的检测以及基于石墨烯的检测都为microRNA的检测提供的方法。分子信标(MB)，是发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，已被广泛用于检测DNA和RNA，具有很高的灵敏度和特异性，但是MB在活细胞中识别miRNA同源序列的应用仍然鲜有报道。近年来，几种新的miRNA检测方法已被报道，如安培磁力生物传感器、基于水凝胶的微流体方法以及等速电泳方法。虽然，电化学磁敏传感器等在检测miRNA有很高的特异性，但病毒蛋白的选择性识别是必要的。基于芯片上修饰水凝胶的方法和等速电泳法在检测miRNA中被证明是有效的，然而这些技术在检测活细胞中的miRNA的时候是非常复杂和耗时的。荧光原位杂交(FISH)被认为是活细胞中检测基因表达的最常用的方法，但是它的识别单碱基错配的miRNAs的能力是有限的。最近，四嗪介导的转移反应和滚环信号放大的方法已成功地应用于miRNA的检测和成像，然而，这些方法非常繁琐且不容易被广泛使用。因此，亟待需要一个更简单有效的、高度特异性的、敏感的miRNA的检测和成像的方法。

发明内容