[发明专利]一种禽流感病毒检测试剂盒

权利要求书

1.一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述吸水垫放置于所述塑料小盒的凹槽处，所述硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间；

所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：

(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10～12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；

(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38～40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；

(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-10～-5℃保存；

(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40～60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低温保存；所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇-20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30～35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针；

所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的混合液。

2.一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长0.6～1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小1/3到1/2；

所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：

(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10～12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；

(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38～40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为12.8～24.6MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；

(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-10～-5℃保存；

(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40～60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低温保存；

进一步地，所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30～35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针；

所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液。

3.一种禽流感病毒检测试剂盒，其特征在于，包括禽流感病毒囊膜抗原、纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成，所述塑料小盒的盒盖中央有边长0.6～1.0cm的正方形孔，盒底部有一位置与盒盖上的方孔对应的方形凹槽，大小与盒盖上的方孔一样大；吸水垫放置于盒的凹槽处，硝酸纤维素膜放在吸水垫与盒盖之间，吸水垫的面积比硝酸纤维素膜小1/3到1/2；

所述点加了禽流感病毒囊膜抗原的硝酸纤维素膜采用如下方法制备得到：

(1)禽流感病毒培养：将禽流感病毒接种于10～12日龄的鸡胚尿囊腔中，用石蜡封存后37℃孵育繁殖40h，再将鸡胚置于0℃环境中10h，待红血球凝固，取出，收获尿囊液，即得到禽流感病毒；

(2)抗原提取与分离：将所得到的禽流感病毒溶于PBS缓冲液中，38～40℃，保温20min，再按1:1的体积比加入弗氏佐剂，超声处理10min，超声频率为12.8～24.6MHz；再用DEAE-葡聚糖凝胶作为交换剂，采用离子交换法进行分离，得到禽流感病毒囊膜抗原；

(3)抗原浓缩：将步骤(2)制备的禽流感病毒囊膜抗原冷却成固体，缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至1.23～1.35μg/mL，即得抗原浓缩液，-10～-5℃保存；

(4)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的禽流感病毒囊膜抗原溶液中，静置40～60min，待硝酸纤维素膜充分吸附禽流感病毒囊膜抗原，取出，于-15～-5℃低温保存；

进一步地，所述的纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针的制备方法为：先用王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入还原剂，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；将纳米金溶液用碳酸钾溶液调节其pH至8.0，将兔抗鸡IgY抗体稀释至0.80～0.90mg/ml，15000rpm、4℃条件下离心30min，得上清液，迅速滴加到纳米金溶液中，搅拌均匀，再按10:1的体积比加入聚乙二醇20000，再按1:1的体积比加入封闭液，室温继续孵育30～35min，15000rpm，4℃条件下离心30min，去除上清液，稀释液重悬沉淀并洗涤一次，得到纳米金标记兔抗鸡IgY抗体的检测探针；

所述的还原剂为柠檬酸和柠檬酸钠的按1:9的混合液；

原理是：应用斑点金免疫渗集中滤法进行检测，以硝酸纤维素膜为载体，在包被了抗原的渗滤装置中，依次滴加待测标本、免疫金及洗涤液，因吸水垫置于硝酸纤维素膜底部，故待测标本流经渗滤装置时与膜上的抗原快速结合，再与金标抗体结合，形成抗体-抗原-金标抗体复合物，吸水垫的面积相对硝酸纤维素膜较小，可以使发生反应的抗体-抗原-金标抗体复合物集中向中间部位聚集，并起到浓缩作用，进一步增强显色效果，达到快速检测目的，阳性反应在膜上呈现红色斑点。