[发明专利]基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种gRNA序列及通过CRISPR-Cas9系统对乙肝病毒进行基因编辑的技 术，属于基因突变和基因工程技术领域。

背景技术

乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(HepatitisBVirus，HBV)引起的严重传染性疾 病。全球共有20亿人感染过乙肝病毒，其中约4亿人为乙肝病毒慢性感染者，HBV持续感染会 导致其中部分患者恶化为肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV引起的肝脏相关疾病的人数达到 一百万人。我国是乙肝大国，现有HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万 例。每年用于乙肝治疗的直接费用超过1000亿元，乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的 重大问题。虽然目前乙肝疫苗已广泛应用，在一定程度上预防了HBV新发感染，降低了乙肝 发病率。但对于慢性HBV感染者，仍需通过有效的抗病毒治疗来缓解病情、延缓或阻断肝硬 化进程、防止出现肝衰竭或肝细胞癌变等严重后果。目前，常用的乙肝抗病毒治疗药物有干 扰素和核苷类似物等。干扰素(Interferon,IFN)具有直接的抗病毒和免疫调节作用并可有 效提高机体免疫力，但干扰素治疗有严格的适应证和禁忌证，适于干扰素的患者仅1/3获得 持续应答，而且副作用较多。核苷类似物(NucleostideAnalogues，NAs)可通过抑制DNA逆 转录酶活性从而抑制乙肝病毒的复制，然而，乙肝患者在口服NAs抗病毒治疗过程中会出现 诸多问题:疗程难以确定，大多数患者需要长期治疗甚至终身治疗，而随着治疗时间的延 长，产生HBV耐药性突变的风险也随之增加。重要的是，肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA) 的持续存在是HBV慢性感染和复发的根源。此外，HBV在复制过程中还能够与细胞基因组进 行整合，而这种整合改变了内源性基因的功能或者染色体不稳定，从而诱导肝细胞癌的发 生。长期以来，一直未能找到以cccDNA和整合的HBVDNA为靶点的药物或其他治疗方法。NAs 虽然能明显抑制病毒复制水平，使病毒DNA含量下降或消失，但由于肝细胞核内产生新病毒 的根源(病毒复制模板cccDNA)未能根除，即使患者在达到治疗终点后停药，残存的病毒也 可能以cccDNA为模板再次大量复制，激发强烈的免疫应答，导致短期内广泛肝组织损伤，病 情复发，严重者可以导致重型肝炎或肝衰竭。

近年来出现的DNA编辑技术可以对任何物种进行DNA的精确编辑，使得从根本上清 除cccDNA和整合的HBVDNA成为了可能。目前主要的基因编辑技术包括：锌指核酸酶(Zinc Fingernucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TranseriptionAetivator-like EffectorNueleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)/Cas9系统。ThomasJ Cradick等构建了针对HBVC基因的ZFNs系统，并使得HBV前基因组RNA(pgRNA)降低了约 29％，BloomK等利用TALENs有效干扰相应的HBV靶序列并抑制了病毒的复制，在 HepG2.2.15中，经过3次转染，导致约35％的cccDNA发生突变，在水动力法转染HBV小鼠模型 体内也显著抑制了病毒复制。然而ZFNs和TALENs系统组装与筛选复杂，存在细胞毒性、易脱 靶、构建成本偏高等问题，加之TALENs可能引起的免疫反应限制了其应用和发展。CRISPR- Cas9技术的出现有望克服上述不足，实现从根本上破坏或清除HBV的目标。