[发明专利]人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用

说明书

本发明公开了一种Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208‑Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208‑Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物。此外，还公开了上述Egfl8基因过表达慢病毒的构建方法。本发明首次构建了Egfl8过表达慢病毒，能够高效便捷地感染肝癌细胞并明显上调后者中Egfl8基因的表达，能够有效降低肝癌细胞的侵袭运动能力，从而为肝癌的治疗提供了非常有效的抑制基因，对于肝癌的Egfl8基因治疗药物的制备具有重大意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种Egfl8基因过表达慢病毒在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

Egfl8（epidermal growth factor-like domain 8，表皮生长因子样结构域8）是由Fitch等于2004年首先在小鼠中发现，其位于小鼠的17号染色体上，编码一个由293个氨基酸组成的蛋白。人Egfl8基因则位于第6号染色体上(6p21.32)，与MHC区域相邻，编码一个分子量为32KD的分泌型蛋白。Egfl8蛋白包含有一个EGF样结构域、一个钙离子结合型EGF样结构域和N末端的信号肽。

近年来，已研究证实Egfl8在结直肠癌组织中的表达明显下调，且其低表达与结直肠癌的远处转移、TNM分期及不良预后密切相关。此外，Egfl8在胃癌组织中亦呈低表达，且其表达水平的下调与胃癌的腹膜播散及TNM分期密切相关。这些结果提示Egfl8在人类恶性肿瘤的侵袭转移中发挥了重要作用。而国际上最新的研究显示，下调小鼠胸腺上皮细胞中Egfl8的表达可使细胞粘附分子ICAM-1的表达明显上调，上调Egfl8的表达则可使ICAM-1的表达明显下调，即Egfl8对胸腺上皮细胞中ICAM-1的表达具有反向调控的作用。此外，体内注射重组的Egfl8蛋白可抑制小鼠胸腺组织中Notch信号传导通路的表达。

综上所述，目前国内外对于Egfl8的研究，大多是集中于Egfl8在肿瘤组织中的表达情况及其与肿瘤恶性程度及临床表现的相关性等方面，而对于Egfl8在人类恶性肿瘤尤其是肝癌组织中的作用及机制等方面研究较少。Egfl8在细胞系中的研究也仅见于胸腺上皮细胞，并且目前又缺少高效稳定上调肿瘤细胞中Egfl8表达的手段和方式。因此，构建Egfl8过表达慢病毒载体及相应慢病毒，观察其感染肿瘤细胞后所产生的作用，对于研究Egfl8在肿瘤发生、发展中的作用及机制都十分重要。目前，尚未见到关于构建Egfl8过表达慢病毒的研究和报道，也尚无任何研究报道Egfl8在肝癌侵袭转移中的作用及机制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒及其构建方法和应用，以高效便捷地实现Egfl8基因在肝癌细胞中的稳定过表达，通过感染HCCLM3肝癌细胞系，从而抑制该肝癌细胞系的迁移运动能力。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明提供的一种人肝癌细胞Egfl8基因过表达慢病毒，包括含目的基因的GV208-Egfl8慢病毒载体、以及慢病毒包装辅助载体pHelper 1.0质粒和pHelper 2.0质粒；所述GV208-Egfl8慢病毒载体包括GV208慢病毒表达载体、以Egfl8 cDNA 克隆为模板的Egfl8 cDNA PCR产物；其中PCR扩增引物为：

Egfl8上游引物：

GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGTCCAGGGCTGAGCTGTGCACTC（序列1）

Egfl8下游引物：

TCACCATGGTGGCGACCGGTCGATGATTGACGCCGAGGC（序列2）。