[发明专利]用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物

说明书

技术领域

本发明属于法医DNA检验分析领域，具体涉及用于微量降解生物样本miniSTR分析的ZNA引物。

背景技术

短串联重复序列(shorttandemrepeat，STR)又被称为微卫星DNA(microsatelliteDNA),是人类基因组中分布较为广泛的一类遗传标记，其核心序列一般由2～6个碱基组成，核心序列的重复单位数目不同导致同一基因座中存在不同的等位基因。由于其重复单位较为简单，也被称为简单重复序列(simplesequencerepeats，SSRs)。由于核心单位数目的变化，使STR的长度在人群中变异较大，构成了STR的遗传多态性，进而成为STR分析技术的生物学基础。STR序列绝大多数分布于基因组非编码区，核心重复序列呈串联排列，扩增片段一般在400bp以下，目前在法医个人识别及亲子鉴定中得到了广泛应用。然而在实际应用中，由于物理、化学以及天气等环境因素的影响，检材中DNA分子易发生降解、断裂，经常得不到完整的DNA分型甚至分型失败，这就给法医学分析带来了很大的困难。为了解决上述降解生物样本的分型问题，产生了一种新的STR分型技术：在设计引物时，使其结合在更靠近核心重复序列的侧翼序列，PCR扩增的产物就会比STR基因座更短一些，即miniSTR技术。

虽然miniSTR分型技术在对降解生物样本的分析中获得了很大的成功，但其应用仍然存在一定的局限性。例如，由于受限于STR核心重复序列的长度，miniSTR的扩增片段长度不可能无限的减小，这就令不同基因座的miniSTR扩增片段分布更为集中，各个基因座的等位基因片段长度范围相互重叠的机率比普通STR要高得多。因此基于miniSTR原理设计的荧光标记复合扩增试剂盒不可能同时容纳很多基因座，一次检验所提供的信息量较少，必须增加复合扩增的次数。此外，当DNA模板数量很少或者样本扩增产量很低的时候，miniSTR的使用就会受到限制。另外，PCR扩增产物的长度小于150bp的时候，剩余在引物上的染料分子会对电泳图谱产生影响。而在实际的法医学检案工作中，由于环境因素等影响，使用的生物样本通常既是降解样本，同时往往也是低拷贝数((Lowcopynumber，LCN)样本，即DNA含量少于100pg，相当于15个双倍体或30个单倍体细胞的生物样本。

为提高LCN生物样本的法医学STR分型的灵敏度和成功率，通常采用两种策略。一种是增加PCR反应的循环次数，提高STR基因座扩增成功率和产物量，而后进行DNA分析。虽然增加PCR循环数能够提高LCN样本的STR成功检出率,但存在以下风险：实验室环境和操作污染对样本STR分型的干扰作用变得更加明显；非特异产物大量积累，分型精确性大幅下降；分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、甚至丢失的现象。另一种策略是首先进行LCN样本的全基因组扩增，获取足量的DNA模板，而后进行STR分型。这种策略也存在一些实际应用的缺陷：发生等位基因丢失；针对特定类型检材的全基因组扩增技术尚不明确等。

法庭科学STR基因组的选取需要考虑众多因素，其中首要因素是STR基因座的个体识别力(Powerofdiscrimination，PD)。美国联邦调查局(FBI)在1997年选定了13个核心STR基因座用于建立DNA联合索引系统(CODIS)：CSF1P0、D3S12358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、FGA、HUMTH01、TPOX、Vwa。为进一步增强区分度，FBI随后又在CODIS数据库中加入了基因座D2S1338和D19S433。目前常用的商品化STR复合扩增试剂盒，如ABI公司的IdentifilerTM以及Promega公司的PowerPlex等，均包括上述13个核心STR基因座。然而STR基因座的多态性在不同种族和人群中存在明显的差异，上述STR基因座的选取主要是基于西方人群所选定的，在实际应用中并不一定适用于中国人群。

未解决上述问题，中国专利公告CN1327005C公开了一种荧光标记STR基因座的复合扩增检验系统,该系统包括14个适合中国人群的STR基因座。该系统使用的DNA引物能够将相应基因座扩增产物控制在400个碱基(bp)的范围内，灵敏度达到0.125ng。该系统虽然提供了适合中国人群的STR基因座，但是由于其检测灵敏度的限制，难以实现对LCN样本的检测。