[发明专利]水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用

说明书

本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记引物及应用。申请人通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到一个Pi25基因内特异SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物，分别为：Pi25‑PF:GGGATCTAGGCAGACAGT；Pi25‑PR:CAGAGCAGGAACTTCAGTTG；Pi25‑NR:GATGCAGGATAAAGAATGAA；Pi25‑NF:AGCTGTGGCAAGCCTAACAG。利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Pi25的基因型。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi25基因型鉴定。

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对Pi25基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的Pi25基因型抗性亲本。

技术背景

水稻是超过50％世界人口的主要食物。随着世界人口的不断增加,对水稻产量的需求日益增加。稻瘟病是我国稻作区最严重的病害之一，也是全世界水稻生产的威胁。据报道在1975-1990年之间全球由稻瘟病引起的水稻损失高达1.57×1011kg，我国稻瘟病年发病面积约380万公顷，发病面积占6％，年损失稻谷约10亿公斤，2000年以来在西南、东北呈偏重流行态势，由于危害面积和危害程度日趋严重，稻瘟病已经成为水稻高产稳产的严重障碍。选育和推广抗病水稻品种(组合)是控制水稻稻瘟病病害最安全、经济和环保的方法，抗病基因的发掘、评价和合理应用成为当今水稻抗病育种和生产的基础。然而在实际生产中，稻瘟病生理小种变异很快，含有单一抗性基因的抗性品种长期使用便会因为稻瘟病菌新的优势种群的出现而抗性渐失，因此，并利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种成为解决问题的最佳途径。

Pi25位于水稻6号染色体短臂靠近着丝粒的区域(Chen Jie et al.A Pid3allelefrom rice cultivar Gumei2confers resistance to Magnaporthe oryzae.Journal ofGenetics and Genomics 38(2011)209-216)，它的供体亲本来源于谷梅2号，是一个具有对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的品种，因此对于培育具有广谱抗性的水稻品种具有巨大的利用价值。目前等位性测定的方法是通过对含有不同等位基因的材料在温室内进行不同稻瘟病生理小种接种鉴定，根据它们的抗谱差异将不同等位基因区分开来，但这种方法存在实验周期长、复杂、繁琐，因此限制了它在育种中的应用。

分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种技术，但目前还没有对Pi25基因内特异性共显性分子标记的报道。本研究通过对Pi25来源材料的Pi25编码区的等位基因进行了PCR扩增、等位基因重测序，最终在Pi25基因ATG启动子后+2566bp处获得一个Pi25特异性SNP位点，Pi25等位基因型为C碱基，其余基因型均为G碱基，在两对交叉引物PCR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第三位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，如图1所示，通过设计4条引物(PF、PR、NF、NR)并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定Pi25基因型，如果扩增出383bp条带则为纯合Pi25基因型，其余等位基因类型扩增条带为266bp，而杂合型则同时具有两条条带，并且三者还会有一条612bp的共有条带。因此该方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Pi25基因型鉴定。

发明内容