[发明专利]调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及到一种调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的microRNA及其应用。

背景技术

家蚕质型多角体病毒(Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus,BmCPV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，是危害养蚕业的主要病原物之一，给生产上造成了巨大经济损失。BmCPV病毒粒子直径约为50-65nm，形状呈正二十面体，具有独特的单层衣壳结构。基因组由10节段双链RNA分子组成，其中H株第9片断(GenBank:AF061200)和I株第9片断(GenBank:AF061199)均为1186bp，编码36kD的NS5，该蛋白具有dsRNA结合活性。目前把质型多角体病毒按照电泳迁移率的不同分成14个电泳型，BmCPV属I型。其宿主域主要是鳞翅目，双翅目，膜翅目和鞘翅目等昆虫。BmCPV专一性感染家蚕中肠上皮细胞，感染了BmCPV的家蚕中肠上皮细胞发生显著病变。感染家蚕表现为发育不良、体形瘦弱、行动呆滞。随着病程的推进，在中肠后部可看到白色的褶皱，这是家蚕质型多角体病的典型病症之一。

MicroRNA(miRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的小的非编码RNA。miRNA广泛存在于动物、植物和病毒等生物中，在物种进化中高度保守，并具有时空表达特异性，参与包括生长发育、细胞凋亡、肿瘤、抗病毒等一系列重要的生命过程。研究表明，宿主编码的miRNA在受到病毒感染后，其表达水平会发生显著变化。Fullaondo等预测在果蝇中，有超过70个miRNAs参与果蝇免疫系统相关的Toll信号通路、Imd信号通路以及JNK和JAK/STAT信号通路的调控，推测由miRNA介导的RNA干扰途径可能是果蝇先天的广谱型免疫机制。miR-8是经实验室验证的和昆虫免疫应答相关的miRNA。它可负调控果蝇中编码Drosomycin以及Diptericin等抗菌肽(AMP)基因的表达，使得AMP在非感染情况下维持较低水平从而确保免疫反应维持内稳态。果蝇中若缺失miR-8，体内的AMP将显著升高。miR-8对AMP的负调控也在小菜蛾(Plutellaxyloshella)的幼虫实验中得到证实。该研究还发现，miR-8可正向调控Serpin-27的表达，Serpin-27可抑制Toll通路的激活。当感染病原菌时，由于miR-8表达下调从而抑制Serpin-27表达，进而激活Toll通路。研究表明，宿主基因组编码的miRNA既可调控宿主的基因也可作用于病毒的基因，从而调控病毒的增殖。Zhu等研究发现，AcMNPV-miR-1可下调ODV-E25基因的表达，导致芽殖类病毒粒子复制减少，加快有包涵体病毒粒子的成形。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种可调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因表达的microRNA分子及其应用。

技术方案：调控家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因的miRNA，命名为bmo-miR-274-3p，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：

5’-GUUUGUGACCGUCACUAACGGGCAGU-3’

所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒增殖中的应用。

所述miRNA在抑制家蚕质型多角体病毒编码的NS5基因中的应用。

抑制家蚕质型多角体病毒增殖的药物，有效成分为权利要求1所述的miRNA。

检测所述miRNA表达水平的茎环荧光定量PCR试剂盒，包括反转录系统、扩增系统和引物系统；所述反转录系统由gDNAEraser、5×gDNAEraserBuffer、PrimeScriptRTEnzymeMixI、5×PrimeScriptBuffer2、茎环引物、RNase-freeddH₂O组成；所述扩增系统由2×SYBRPremixExTaq、bmo-miR-274-3p正向引物、bmo-miR-274-3p反向引物、ddH₂O组成；所述引物系统由茎环引物、bmo-miR-274-3p正向引物、bmo-miR-274-3p反向引物、snU6内参正向引物，snU6内参反向引物组成，引物浓度均为10μM；序列如下：

茎环引物：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGCCCG-3’；

正向引物：

5’-ACACTCCAGCTGGGGTTTGTGACCGTCACTAA-3’；

反向引物：