[发明专利]一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用

说明书

本发明提供一种编码6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。6‑磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因pgdhD2来源于甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200，具有L‑丝氨酸抑制效应。以甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200为出发菌株，以同源双交换方法构建了pgdh基因缺失突变菌DMB，获得产L‑丝氨酸能力大大强于出发菌株Methylobacterium sp.MB200的L‑丝氨酸高产突变菌株，可耐受D‑丝氨酸浓度大大高于出发菌株。本发明提供的pgdh基因缺失突变菌在发酵法生产L‑丝氨酸生产上具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种编码6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的基因及其应用。

背景技术

L-丝氨酸具有重要的生理功能和应用价值，广泛应用于医药、食品和化工领域。目前，L-丝氨酸的生产方法主要有化学合成法、蛋白水解法、酶法转化和微生物发酵法。微生物发酵法生产L-丝氨酸是一种绿色、环保的生产方式，但由于存在反馈抑制调节作用，微生物很难大量积累L-丝氨酸，故微生物发酵法生产L-丝氨酸的产率相对较低，限制了该方法的应用。

解除L-丝氨酸反馈抑制调节，提高发酵法生产L-丝氨酸产率的方法，一是通过对L-丝氨酸生物合成途径中关键的酶基因进行进化改造，获得具有抗L-丝氨酸反馈抑制调节的关键酶，解除L-丝氨酸的反馈抑制，构建L-丝氨酸高产菌株；二是改造非合成途径如EMP途径、HMP途径、L-丝氨酸转化途径、转运途径等的关键酶，也可以降低或解除L-丝氨酸反馈抑制，构建相关基因突变型L-丝氨酸高产菌株，解除L-丝氨酸的反馈抑制。

解除L-丝氨酸对合成途径关键酶的反馈抑制是构建L-丝氨酸高产菌株的关键，基因进化改造是改造代谢途径关键酶及其基因表达调控序列的主要手段。已经有利用分子生物学技术进行相关研究以降低合成途径中关键酶对L-丝氨酸的敏感性，使得工程菌株具有抗L-丝氨酸反馈抑制调节以提高L-丝氨酸积累能力，提高生物合成L-丝氨酸的产率。如中国专利申请(公开号103436504A)公开了以L-丝氨酸产生菌株谷氨酸棒杆菌SYPS-062为出发菌株，采用基因组工程手段对催化其生物合成途径第一步反应的3-磷酸甘油酸脱氢酶进行进化改造，实现抗L-丝氨酸反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体的组成型稳定表达，获得稳定表达抗L-丝氨酸反馈抑制的3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体，构建了L-丝氨酸高产菌株。中国专利(公开号1609208)公开了将大肠杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)的第349位甘氨酸或第372位苏氨酸的取代，获得的突变体对L-丝氨酸的敏感降低，取得较好的效果。中国专利申请(公开号102433312A)同样采用定点突变，将3-磷酸甘油酸脱氢酶(3-PGDH)第344位组氨酸突变为丙氨酸和第346位天冬酰胺突变为丙氨酸，突变体酶活不受L-丝氨酸抑制且酶活能够较大程度保留。

甲基营养菌Methylobacterium sp.MB200是从沼气池里的残渣中筛选分离出的一株产L-丝氨酸菌株，由于其可利用非C-C键的低碳复合物如甲醇生长，故而有区别于其他产丝氨酸微生物如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌的代谢途径。研究发现，在甲基营养菌如Methylobacterium extorquens AM1中，具有如图1所示的复杂的代谢网络。由图1可知，在甲基营养菌中，甲醇先氧化为亚甲基四氢叶酸，然后与甘氨酸作用生成L-丝氨酸。甲基同化主要是通过C1途径和丝氨酸循环来实现的，而C1途径、丝氨酸循环又通过不同的碳化合物、辅酶、ATP等与EMP途径、HMP途径、TCA循环发生联系，形成一个相互影响、相互牵连并受到有序调控的代谢网络。