[发明专利]用内源安全标记表达胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程真菌及其构建方法

权利要求书

1.用内源安全标记表达胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程真菌，其特征是：菌株BbHUV5的保藏名称为：球孢白僵菌Beauveriabassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年12月02日，保藏编号：CGMCCNo.11802。

2.根据权利要求1所述的用内源安全标记表达胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程真菌的构建方法，其特征是包括以下步骤：

（1）载体构建

根据目标基因开放阅读框(ORF)及其载体的序列确定合适的酶切体系，分别提取pAN52-Phydl-tl-Vip3A和p0380-ura3质粒，经XbaI和HindIII双酶切，回收正确酶切片段并通过T4连接酶连接而成新质粒，经转化、PCR鉴定、酶切鉴定，获得阳性大肠杆菌转化菌株，然后，扩增ura3的ORF并测序确认，选取正确转化子即为新载体pAN52-Phydl-tl-vip3Aa1-ura3；

（2）ura3缺失株感受态芽孢子转化与筛选

将所构建的双元质粒经HindIII酶切线性化，再用PEG和LiAc介导的ura3缺失株经芽生孢子转化体系将其转化到其基因组中，筛选出阳性克隆，进行转化子中vip3Aa1基因的转录水平分析；

（3）获得内源安全标记表达昆虫胃毒蛋白的转基因生防工程菌株

筛选转录水平最高的转化子，以BbV28作为对照，进行酶联免疫吸附测定即ELISA实验，以检测Vip3Aa1蛋白在转化子中的表达水平，获得内源安全标记表达昆虫胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程菌株BbHUV5，保藏编号为CGMCCNo.11802。

3.根据权利要求2所述的用内源安全标记表达昆虫胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程真菌的构建方法，其特征是：所述步骤（3）中的生防真菌为球孢白僵菌。

4.根据权利要求1所述的用内源安全标记表达胃毒杀虫蛋白的转基因生防工程真菌的用途，其特征是：用于胃毒杀虫，不需要外源标记，避免了原先除草剂标记下工程菌株的环境风险。